蛋白质的裂解.pptVIP

1．原理 。溴化氰（CNBr）裂解法是多种化学法中最重要的 也是最常见的方法。 。由Gross和Witkop于1962年建立的。后人进行了系统 研究, 能专一裂解蛋氨酸残基的羧端，产率达到85% 。由于蛋白质中的Met一般都比较少，因此裂解后的肽 段较少，新生成的肽段往往是大肽段，这样很适合于 自动顺序仪测定，更适用于固相法测定。与胰蛋白酶 裂解法配合起来，通常很容易获得肽段的排列顺序 （－）溴化氰裂解 第30页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 CNBr裂解蛋氨酸残基的反应机理： CNBr 裂解肽链的甲硫氨酸羧基所形成肽链的反应 第31页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 在酸性条件下氨基质子化，可以避免一些副反应 如：用70％甲酸可以破坏肽链的卷曲，使甲硫氨酸侧链暴露，有利于CNBr的裂解 甲硫氨酸的氧化产物亚砜Met(SO) 或砜Met(SO3)不能与CNBr反应 为防止甲硫氨酸被氧化，整个反应应在氮气流或充氮容器中进行 当甲硫氨酸在N末端，则产生游离的高丝氨酸内酯： 第32页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 当肽链中有二个相邻的甲硫氨酸，则产生一游离高丝氨酸内酯和二个新肽段： 当甲硫氨酸在C末端，则C末端变为高丝氨酸内酯： 第33页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 第1页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 用Edman降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺序时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用 裂解条件要求： 裂解点少 专一性强 反应产率高 裂解方法： 酶法 化学法 酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段 一、 引 言 早期：部分酸水解法裂解，由于专一性 低，裂解后生成很多小肽，造成 分离纯化困难，工作量也很大。 中期：生化学家改用蛋白酶酶解，因专 一性强，故被广泛地使用。 后来：随着自动顺序仪的广泛使用和对 大肽段的需求，发现某些化学试 剂对蛋白质的裂解有特异的优点。 化学法再流行。 第2页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 （－）简述 用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：专一性强，降解后的肽段容易纯化，产率较高，副反应少，在酸水解中容易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不受影响。 整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要考虑下列因素： （1）合适的pH （2）适宜的反应温度 （3）恰当的酶与底物的比率 （4）选择相应的反应时间 二、蛋白质的酶裂解 第3页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 第4页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 最常用的水解蛋白酶，专一性强,只断裂赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可得到合适的肽段 商品胰蛋白酶中，常含有少量胰凝乳蛋白酶，这样，在酶解时会产生不希望有的肽片段。因此，使用前需用L-1（对-甲苯磺酰）苯丙氨酰氯甲酮（简称TPCK） 处理胰蛋白酶，以抑制胰凝乳蛋白酶的活力。也可直接订购用TPCK处理过的胰蛋白酶。 1、胰蛋白酶 第5页，共47页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 讨论： 如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很大麻烦。 方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的ε-氨基，使胰蛋白酶酶解时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后也很容易去掉保护基团。 ε-