蛋白质糖基化的研究及进展.pptVIP

第1页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 1 概 述 1988年，牛津大学的 Raymond Dwek 在 Annual Review of Biochemistry上发表题为 “糖生物学”的综述，标志糖生物学这一前沿领域的诞生。 美国的新罕布什大学 首先开展了“糖组学”（glycomics) 的研究 美国于2001年正式启动了“功能糖组学”的研究 第2页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 “功能糖组学” 研究目标 基因组计划提供了基本的遗传信息，而许多基因的功能仍需要阐明。其中的关键就是蛋白质的翻译后修饰，而糖基化是最主要的翻译后修饰之一。 阐明由蛋白质-糖链所介导的细胞通讯机制 糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。 第3页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质糖基化研究的基本目标是： 寻找编码糖蛋白的基因 寻找糖基化位点 解析糖链及糖基化肽段的结构 研究糖基化的功能 基因组信息 糖基化位点信息 结构信息 功能信息 第4页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 现代分子生物学的中心法则： 第5页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质的糖基化在生物体是广泛存在的。 真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化 第6页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 糖链的多样性和复杂性 “连接方式异构体” “分枝形成” 第7页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 2 蛋白质糖基化的分类 1．O-糖基化: 糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr 等侧链的羟基处 2．N-糖基化: 糖链连接在蛋白质的Asn的氨基侧链处 3．GPI-Anchor糖基化: 蛋白质通过肽链的C端共价连接 的 糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。 第8页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 3 蛋白质糖基化常用研究方法 因为糖链的复杂性，很难通过单一的方法进行序列测定等研究，需要多种方法组合完成。 糖基化位点分析 糖基化蛋白分析 糖链分析 糖蛋白 糖链释放 单糖分析 蛋白酶水解 去糖基蛋白 氨基酸分析 糖链 糖基肽 肽链 糖链释放 氨基酸序列分析 去糖基肽链 糖链 分馏/纯化 结构分析 酶解 糖基肽/寡糖多糖图谱 质谱 核磁共振 第9页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质糖基化的研究策略 1.凝胶技术与质谱联用 2.非凝胶技术与质谱联用 3.O-β-GlcNAc 糖基化研究 细胞组织 双向电泳 切割 酶切 质谱分析 糖链鉴定 数据库搜索 靶蛋白鉴定及功能分析 与磷酸化之间存在“阴阳”关系 可以被筛选和鉴定 O-β-GlcNA pr 亲和层析 母离子扫描 366 数据库搜索 鉴定 第10页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 4 糖基化蛋白质的分离技术 蛋白质混合物 分离纯化糖蛋白 糖肽 凝集素 ConA 是一种典型的对于一系列高甘露糖型的N-连接糖链具有高亲和性的植物凝集素， 同时也能结合复杂型的N-连接糖链及双分枝的复杂型的N-连接糖链 Mana1-6(Mana1-3)Manβ 较强 Mana1-2Mana1-6 (Mana1-3)Manβ 最强 缺少三甘露糖核心结构或含有阻碍性的3-OH，6-OH取代基团的Mana（α1-6） 较弱 第11页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 Galectin LEC-6 PNA 半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖于金属离子的可溶性凝集素 很多生物具有保守性 倾向于结合包含半乳糖且具有分枝结构的N-连接糖链 花生凝集素是组织化学中用于检测T抗原的。 T抗原在黏蛋白中广泛存在（如血型糖蛋白A） 可广泛结合于存在O-连接糖链的T抗原上 第12页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 5 糖基化蛋白的检测技术 1 荧光染色检测法 丹磺酰肼 检测聚丙烯酰胺凝胶中的糖蛋白 绿色荧光蛋白 即 Pro-Q Emerald 300 染色剂 SYPRO Rubby Pro-Q Emerald 488 第13页，共20页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 2 与凝集素联用的检测方法 蛋白质印迹到膜上后，与标记了地高辛的凝集素一起孵育，再通过与带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合，最后加入显色试剂进行检测。 第