蛋白质的颜色反应和沉淀反应.pptVIP

关于蛋白质的颜色反应和沉淀反应 第1页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 一、实验目的 1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应 2.了解蛋白质的沉淀反应、颜色反应的机理。 第2页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 二、实验原理 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 （一）蛋白质的颜色反应原理 第3页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 （二）蛋白质的沉淀反应原理 蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如-NH3+，-COO-，-SH等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。 第4页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。 蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 第5页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质变性后,有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷),并不析出.因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀,而沉淀的蛋白质也未必都已变性. 第6页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 三、实验仪器、试剂和材料 1.卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2.饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中，在70～80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 3.1%醋酸铅溶液 4.1%硫酸铜溶液 5.0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。 6.浓硝酸：比重1.42。 7.试管及试管架、吸管、量筒等。 第7页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 四、操作步骤 (一)蛋白质的颜色反应 1.双缩脲反应 原理：当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。在碱性条件下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应。 第8页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 第9页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 实验过程 ①取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH 溶液1mL 混匀，观察有无紫色出现。 ②另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。 第10页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 2.蛋白质的黄色反应 实验原理：含有苯环结构的氨基酸，如酷氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应(苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应)。 第11页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 第12页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 实验过程： 在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶液5滴，观察颜色反应。 第13页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 3.茚三酮反应 实验原理：在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。 第14页，共22页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合