蛋白质研究技术.pptVIP

关于蛋白质研究技术; 蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 ; 蛋白质的胶体性质;;蛋白质的紫外吸收;; 丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀;第8页，共126页，2022年，5月20日，7点52分，星期六; 电 泳; ;;第12页，共126页，2022年，5月20日，7点52分，星期六;等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）; 双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis ;第15页，共126页，2022年，5月20日，7点52分，星期六; 层析(chromatography);层析的主要设备;常见色谱柱;自动分步收集器;离子交换层析ion exchange chromatography;离子交换层析法大致分为5个步骤;离子交换层析的原理;凝胶过滤(gel filtration);凝胶过滤的作用机制; 凝胶过滤的过程; 超速离心;第27页，共126页，2022年，5月20日，7点52分，星期六;CsCl密度剃度离心;蔗糖密度剃度离心;蛋白质研究技术平台;蛋白质相关技术;蛋白质样品制备;蛋白质样品制备试剂;;;蛋白质浓度测定;Bradford蛋白浓度测定试剂盒;蛋白质核酸测定仪;蛋白质免疫印迹(WB)原理;蛋白质免疫印迹（WB)过程;蛋白质免疫印迹（WB)过程;SDS所需仪器;SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS)的有效分离范围;配胶所需材料;蛋白质转印槽;半干法转移槽使用说明;Western blot 所需材料;Western blot 操作流程;;Western blot 常见问题;1、背景过深 2、抗体特异性 3、洗膜时间;Western blot 常见问题;;Western blot常见问题;Western blot常见问题;在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？ 解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。;不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？ 解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效??，但可增加蛋白质和PVDF膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。;蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？ 解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2， 30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。 ;怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直? 影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶。;Western blot结果如何分析;研究蛋白质相互作用的技术平台;蛋白质相互作用的网络图谱;蛋白质相互作用的重要意义;;一、酵母双杂交系统;Yeast Two Hybrid原理;酵母双杂交系统的优点;酵母双杂交系统的应用;酵母双杂交系统的局限性;酵母双杂交的实验流程; 将文库质粒共转化入X-BD-酵母 筛选阳性克隆子（四缺，x-gal显色反应） 共转化再次确认相互作用 将阳性克隆子在二缺平板上划线3次 提取酵母质粒，转化E.coli，提取质粒 PCR或双酶切去除含有相同长度cDNA的克隆子 DNA测序 NCBI数据库搜索 ;酵母双杂交基本过程;;酵母双杂交结果; X-β-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析;酵母双杂交测序结果;测序结