DB34∕T 4203-2022 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程.docxVIP

ICS 11.220 CCS B 41 34 安 徽 省 地 方 标 准 DB34/T 4203—2022 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程 Regulation for detection of extraintestinal pathogenic Escherichia coli from swine 2022-06-29发布 2022-07-29实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 4203—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽农业大学提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽农业大学，安徽浩翔农牧有限公司，马鞍山史记动物健康管理有限公司，安 徽省动物疫病预防与控制中心，阜阳市动物卫生监督所，合肥市动物疫病预防控制中心，阜阳市颍东区 枣庄镇农业综合服务站，巢湖市畜牧兽医局，六安市动物疫病预防与控制中心，滁州市凤阳县府城畜牧 兽医站，安徽省猪业协会。 本文件主要起草人：李郁，李亮，谢玉洁，黄晓慧，李超，邢刚，刘雪兰，段倩倩，李春芬，程圣 芳，孙裴，何长生，高亚飞，陈田梅。 I DB34/T 4203—2022 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程 1 范围 本文件规定了猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定所需的主要设备和材料、操作规程、结果报告和废弃 物无害化处理与人员安全防护。 本文件适用于猪肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.6食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 GB 4789.38食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 GB 4789.41食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验 GB 19489实验室生物安全通用要求 SN/T 2025 SN/T 2984 动物检疫实验室生物安全操作规范 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 肠外致病性大肠杆菌 extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC 是一组不同种类的不仅可正常定殖于畜禽等肠道，而且能侵入血液循环系统引起菌血症，并诱发败 血症或局部肠道外感染的大肠杆菌。 4 主要设备和材料 显微镜：10×～100×。 电子天平：感量0.1 g。 恒温培养箱：37℃。 冰箱：0℃～4℃。 无菌培养皿：直径75 mm或90 mm。 无菌试管：12 mm×100 mm，15 mm×150 mm。 麦氏比浊管。 pH计、pH比色管或精密pH试纸。 饱和氯化钠溶液：见附录A中A.1。 30％甘油缓冲盐水溶液：见附录A中A.2。 1 DB34/T 4203—2022 麦康凯培养基（MAC）：按照 GB 4789.6规定执行。 革兰氏染色液：按照 GB 4789.41规定执行。 三糖铁（TSI）琼脂斜面培养基：按照 GB 4789.6规定执行。 蛋白胨水和靛基质试剂：按照 GB 4789.6规定执行。 缓冲葡萄糖蛋白胨水和甲基红试剂、V-P试剂：按照 GB 4789.38规定执行。 枸橼酸盐培养基：按照 GB 4789.38规定执行。 LB固体培养基：见附录A中A.3。 试验小鼠：6～8周龄，体重18 g～22 g，清洁级。 大肠杆菌 O抗原单因子标准血清。 5 操作规程 操作流程 ExPEC分离鉴定的流程示意图见附录B。 操作步骤 5.2.1 样品采集 5.2.1.1 积液。 采集：无菌操作采集病猪的肝脏、肺脏、脾脏、淋巴结、脑等肠外组织，或关节积液、心包 5.2.1.2 保存与运输：病料样品采集后不能及时送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或 30 ％甘油缓冲 盐水溶液中，保存时间不超过 72 h。样品均需采取低温（0℃～4℃）保存和运输。 5.2.2 细菌分离与纯化 无菌操作将病料样品接种于麦康凯培养基（MAC），37℃培养 18 h～24 h，挑取疑似单个菌落（菌 落呈鲜桃红色或粉红色，中等大小，直径 1.0 mm～2.5 mm，圆形，边缘整齐，表面光滑）再次划线接 种于MAC，37℃培养 18 h～24 h（即纯化）后进行大肠杆菌鉴定。 5.2.3 肠外大肠杆菌鉴定 5.2.3.1 形态特征鉴定：革兰氏染色镜检。大肠杆菌为革兰氏阴性直短杆菌，两端钝圆，无芽孢，多 散在，也有成对排列。 5.2.3.2 生化特性鉴定：先取纯化菌落接种