第三章 动物细胞工程制药.pptVIP

（5）其他成分：有些合成培养基中还加有核酸的前体，氧化还原剂等。一般都需要加入5%-10%的小牛血清。 血清的种类 ?? 小牛血清 取自出生 10—30天的小牛 新牛血清 取自出生 24小时之内的新生牛 胎牛血清 取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗体、 补体等对细胞有害的成分最少。 好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。 △血清作用机制： 提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素； 提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子； 提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白； 提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素； 提供良好的PH缓冲系统。 △3.无血清培养基 随着细胞培养的逐渐扩大，无血清培养基的研究已提上日程。 优点： 提供了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响； 减少了由血清带来病毒、真菌和支原体的危险； 供应充足、稳定； 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性； 较少了血清中蛋白对生物测定的干扰，便于实验结果的分析。 无血清培养基需添加如下几类物质： 激素和生长因子：使用最多的是胰岛素 结合蛋白：最经常补充的是铁传递蛋白和白蛋白； 贴附和伸展因子：纤维结合蛋白、胶原 其他有利于细胞生长的因子和元素：包括消除自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素。 培养基的配制（了解） ??? 目前在国内市场主要是干粉型，应正确配制，才能保证培养基质量。配制培养基要注意以下问题： ??? 认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES 等。这些成分有些是必须添加的，有些根据实验需要决定。 ??? 配制时要保证充分溶解。 配制所用的水应是双蒸水或三蒸水，离子浓度很低，三蒸水最佳。 所用器皿应严格消毒。 配制好的培养基应马上过滤除菌，无菌保存于 4℃。 思考题 一、填空 1.细胞培养器材和液体的灭菌方法可分为两类：物理消毒，如——、——、——和——；化学消毒，如——和——。 2.动物细胞培养最适PH为——，最佳温度为——。 3.动物细胞培养基可分为3类：————、————、———— 二、问答 1.要使细胞在体外培养成功要满足哪些基本条件？ △2.动物细胞培养所用合成培养基主要包括哪些成分？各起什么作用? 3.无血清培养基有哪些优点？ 第五节动物细胞培养的基本方法 细胞培养的方法，一般可根据培养细胞的种类分为原代细胞和传代细胞，又可根据培养基分为固定培养和液体培养；还可根据培养容器和方式分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、固定化培养等。不管用哪种方法，其基本技术大同小异。 动物机体组织 单个细胞 原代培养 胰蛋白酶 胶原蛋白酶 稀释 分装 传代培养 旁栏思考1： 寻根问底 一、细胞分离 为了进行细胞培养，首先要从生物体中取得细胞，主要有两种方法： 1.离心分离法：一般800-1000r/min，5-10min 2.消化分离法:常用胰蛋白酶、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA。 二、细胞计数（了解） 一般细胞分离制成悬液准备接种前都要进行细胞计数，然后按需要量接种于培养瓶或反应器中。目前常用的计数法有： 1.自动细胞计数器计数： 原理：让一定体积的细胞悬液经一小孔，并在两个电极中通过，通过的细胞对电极间的电流产生干扰而使电压发生变化，形成信号被记录下来。 优点：计数速度快 缺点：无法分辨活细胞和死细胞； 会误将细胞结团当作单个细胞，使计数值偏 低。 △2.血球计数板计数 原理：计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。 每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。 以大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总细胞数为A，细胞液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总细胞数： 1ml=1cm3=1000mm3， △为了区别细胞的死活，在计数前可进行细胞染色，常用的染色液有如下几种：肽盼蓝，苯胺黑 3.结晶紫染色细胞核计数法 原理：该染液由于具有低渗，并有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，细胞核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。 常用与微载