乳酸含量测定.docxVIP

在Tris-Hcl-水合肮缓冲液中(pH = 9.2),利用乳酸在氧化型烟酰胺腺喋吟二核甘酸(NAD) 存在的条件下，由乳酸脱氢酶(L-LDH)催化生成丙酮酸和还原型烟酰胺腺噂吟二核甘酸 (NADH)。，利用NADH是一种强荧光物质，而NAD+那么无荧光的性质，通过测定NADH在 340nm处吸光度的变化率，可得出的促反响速度，并制得标准曲线，样品中的乳酸可由标 准曲线求得。 L-LDH L.乳酸+NAD - 丙酮酸+NADH水合明丙酮酸腺 由于酶促反响的专属性，可以防止试样中众多共存组分的干扰，减少繁杂的预处理过程。L-乳 酸脱氢酶催化反响为可逆反响，且反响平衡偏向于丙酮酸转化为乳酸。因此，为了保证反响 平衡偏向于正方向，需加水合脱截获丙酮酸而生成丙酮酸腺，以减少丙酮酸的积累，加快酶促 反响的速度。而水合肺对乳酸脱氢酶又有抑制作用，过量的水合腓反而会降低酶促反响速度。 反响溶液的pH值会影响酣的稳定性，酶活性部位中重要基团的解离状态，陋一底物复合 物以及底物的解离状态，从而影响酶促反响速度。最适pH值为9.2。最适温度为37℃o 发现Ni2+、Mn2+、Cu2+、Cr3+、(2。2+对酶促反响速度有抑制作用根据米氏方程,1/v?1/c为直线关系，因此用双倒数作图法所绘1/v?1/c线作为测定乳酸的 标准 曲线，线 性范围 较宽：1.2 X 10-4?2.0 X 10-3mol/L . 步骤： .配制50ml的甘氨酸缓冲液：甘氨酸3.75g,硫酸腓2.6g.,EDTA?2 Na 0.1 g,加适量去离子 水用10 mol/LN aOH溶液调整pH至9.3,再加去离子水至50 ml.配制5ml的硫酸铁溶液，吸取0.8ml置于乳酸脱氢酶中进行稀释 .称量NAD 0.01658g(663.4)溶于5ml蒸锚水瓶中(5mM), 4℃保存至少可用2周.在per小管中加入100 u 1的甘寂酸缓冲液，100 u 1NAD+,2O u 1不同浓度的乳酸锂，2 u 1的乳 酸脱氢酹溶液，置于37℃中反响1小时后，用石英比色皿在340nm处测定吸光度，以乳酸锂 浓度为横坐标，A340为纵坐标绘制标准曲线 .在per小管中加入10。口1的甘氨酸缓冲液，I。。U1NAD+,20 U1不同时间段的进行适当稀释 的发酵液，21Al的乳酸脱氢酶溶液，置于37c中反响1小时后，用石英比色皿在340nm处测 定吸光度，利用标准曲线得出稀释后的发酵的乳酸根含量