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浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 第29页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 第30页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 浓缩胶 样品 分离胶 第31页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 浓缩胶 样品 分离胶 第32页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 分子筛效应 蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 第33页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 第34页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 【操作方法】 １、安装夹心式垂直板电泳槽 1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手对角线的方式旋紧螺丝帽。 5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。 第35页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 1）分离胶的制备（按表3-2配制10%的分离胶） 将制备的分离胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将贮槽的蒸馏水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液。 2、凝胶的制备 第36页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，30 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。 2）浓缩胶的制备（按表3-2配制3%的浓缩胶） 第37页，共85页，2022年，5月20日，21点50分，星期四 3、蛋白质样品的处理 1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400  牛血清白蛋白 MW=66,200  牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200μl样品溶解液中，沸水浴中加热3- 5min后上样。 第38页，共85页，