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Novagen公司的大肠杆菌菌株选择 Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类： 1. 蛋白酶缺陷型 所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834, BL21, BLR,Origami? B, Rosetta?和Tuner?。因此在纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它的缺失，可以保证质粒的稳定。 2. 保证所有细胞以同样量进行表达 Tuner?株及它的衍生株（Origami? B和Rosetta?）是BL21菌株的lacY1缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。Lac渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一致的，这样使蛋白表达浓度可以随着IPTG浓度而改变。通过对IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。一般说来，低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。 第三十页，共四十五页。 Novagen公司的大肠杆菌菌株选择 3. 二硫键形成与溶解性增强 二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB， Origami，Origami B和Rosetta-gami?。在这些菌株中表达蛋白，可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。 4. 稀有密码子的补给 不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。Rosetta?是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。 5. 硒蛋氨酸标记 B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。 第三十一页，共四十五页。 原核表达需要考虑的问题 在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。 第三十二页，共四十五页。 微生物基因工程 李刚 副教授 第一页，共四十五页。 教学内容 一、PCR引物的设计与实验操作技巧；二、基因组文库的建立与筛选；三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中 的应用；四、原核表达系统的选择和高效表达策略； 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。 第二页，共四十五页。 四、原核表达系统的选择和高效表达策略 原核生物表达系统主要包括： 大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等, 其中应用最广泛的是大肠杆菌表达系统。 第三页，共四十五页。 原核表达系统的优点 1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格 低廉； 2、外源基因表达产物的水平高( 如大肠杆菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白量的80%) ； 3、基因背景和表达特性清楚。 第四页，共四十五页。 大肠杆菌表达系统 自20 世纪70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展, 对基因表达的要求更高, 这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。 第五页，共四十五页。 大肠杆菌表达系统的优缺点 优点： 大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、 可以高效表达不同外源基因产物等特点, 是许多外源基因 表达系统中最好的一种, 是目前研究最深入、发展也最完善的表达系统, 大量的有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中获得了超量表达。 缺点： 大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比, 也具有一些缺 点: ①高效表达易形成包涵体。②不能进行翻译后的加工修饰, 如糖基化、磷酸化及酰基化等。 第六页，共四十五页。 大肠杆菌表达系统的操作流程 ??大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下：?  获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。 第七页，共四十五页。 大肠杆菌表达系统的基本概念 首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达