代谢工程改造嘌呤合成途径以提高核黄素产量.docxVIP

代谢工程改造噂吟合成途径以提高核黄素产量 核黄素，又名维生素B2,是人和哺乳动物生长必不可少的一种 营养物质，在生物体内参与多种氧化还原反响，尤其在作为黄素酶类 的辅酶参与细胞中传递氢的相关代谢中起到了重要作用［1］。核黄素 转化为活性形式：黄素腺喋吟二核甘酸和黄素单核甘酸可以参与促进 生物体内碳水化合物的合成、脂肪酸代谢以及呼吸电子链传递［2］。 由于哺乳动物自身不能合成核黄素，因而其在饲料行业、食品医药行 业中都着有广泛的应用［3-4］ o鸟昔三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)是核黄素生物合成的直 接前体［5］,它既可以以糖和氨基酸为底料进行从头合成，也可以利 用嘿吟碱为前体进行补救合成。嘿吟从头合成途径将戊糖磷酸途径生 成的5-磷酸核糖最终转化成GTP和腺嘿吟核甘三磷酸(adenosine triphosphate, ATP) 0以合成GTP为例，其主要可以分为喋吟操纵子 催化 5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate, PRPP)生成肌昔酸(inosincacid, inosinemonphosphate, IMP),以及 IMP催化生成GTP两个阶段。发酵过程中添加GTP可以提高核黄素产 量［6-7］,证明喋吟前体的有效供应对核黄素的生产至关重要。并且 利用代谢工程策略增强GTP的合成也已有很多报道 本文选用的核黄素高产菌株S1在5 L发酵罐中发酵52 h,核黄素产 量可达27 g/Lo在此基础上利用基于CRISPR/Cas9的碱基编辑器失 活喋吟操纵子阻遏蛋白基因以及鸟喋吟核甘酸(guanylate,GMP)还原 酶来分别提高GTP合成中2个阶段的通量。另一方面尝试过表达GMP 到2,5-二氨基-6-(5-磷酸-D-核糖氨基)喀咤-4(3H)酮(DARPP)合成途 径的基因以增强GTP的合成。 1.2实验方法喋吟合成途径基因过表达及失活菌株的构建 1.2. 1. 1质粒构建以SG质粒为例，以pHP13-spe-PvegI-mcherry质粒为模板，用引物 pHP131、Pveg「2扩增含壮观霉素抗性基因以及PvegI启动子的pHP13 质粒骨架，以B. subtilisl68基因组为模板，用引物UP-gmk、DN-gmk 扩增gmk基因片段，将扩增出来的2个片段用Gibson试剂盒两片段 连接，化学转化DH5a后，挑取长出的菌落用CXPHP131. CXPHP132 引物进行验证，正确的转化子大小为1 293 bp,验证且测序正确后 接入无抗的LB培养基中培养14?17 h提取质粒。 1.2. 1.2喋吟合成途径基因过表达向目的菌株中用电转化［11］的方法转入相应基因的过表达质粒，以终 质量浓度为150 ug/mL的壮观霉素进行筛选获得正确的转化子后保 藏。 1.3碱基编辑器质粒的构建及嘿吟合成途径基因失活碱基编辑器失活guaC和purR的质粒基于实验室中构建的碱基编辑器 质粒pHP13-spe-dcas9o质粒以pHP13为骨架包含复制起始位点Puc ori,复制蛋白Pep pTA1060,壮观霉素抗性基因spe。其余局部包括 乳糖/IPTG诱导的阻遏蛋白基因lacl, PgraC启动子表达dcas9及脱 氨酶(adenosine deaminase, AID),其中 dcas9 缺失终止密码子，PvegI 启动子连接仅缺少N20的向导RNA。在插入N20序列时，首先需要找 到相应基因序列前中段合适的NGG序列，NGG序列上游20 bp为N20 序列，由于在NGG上游15?20 bp更容易利用碱基编辑器发生编辑， 所以在NGG上游15?20 bp寻找使C变为T而产生终止密码子的突变， 设计N20以构建质粒。以PDC质粒为例，以pHP13-spe-dcas9质粒为 模板，用引物UP-dcas9-guaC DN-dacs9扩增片段1,用引物UP-dac9 DN-dcas9-guaC扩增片段2,将扩增出来的2个片段用Gibson试剂盒 两片段连接，化学转化DH5 a后，挑取长出的菌落用CX13 spe2、CXJF2 引物进行验证，正确的转化子大小为624 bp,验证且测序正确后接 入无抗的LB培养基中培养14?17 h后提取质粒。 向目的菌株中用电转化的方法转入相应基因的碱基编辑器质粒，以终 质量浓度为150 Ug/mL的壮观霉素进行筛选获得正确的转化子后， 进行传代培养使目的位点发生编辑并且使质粒丧失，影印后对质粒丢 失的菌进行测序，得到相应密码子突变成终止密码子的菌株进行保藏。 核黄素浓度的测定取 500 口 L 发醉液样品于 1. 5 mL EP (eppendorf)管中，用 0. 1 mol/L NaOH溶液稀释适宜倍数，避光碱