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分离纯化过程中蛋白质的稳定性 蛋白质的稳定性 蛋白质的稳定性主要是指保持其生物活性的能力。与蛋白质结构，构象有关。 关系到分离纯化的活性收率，生产成本。 关系到蛋白质制剂能否应用和商品化。 在分离纯化过程中关注的是： 那些因素影响蛋白质稳定性。 如何减少活性损失，保持稳定 失活机理 失活包括两个步骤： N D I 天然态N：肽连正确折叠，紧密，球或棒状 分子， 自由能最低(40-120kj/mol)。 过度态D：构象变化，包括若干中间态，可逆，部分 或大部失活。 失活态 I ：完全变性，无序结构，不可逆，自由能最 高(＞400kl/mol)。包括共价键变化、SH氧 化、SS键还原、磷酸化、脱氨。 失活机理 天然态在一定程度上仅是热力学稳定，低自由能使其倾向于不稳定，环境的微小变化也会引起负自由能变化。自由能仅决定平衡时的天然态和可逆变性态的比例，不能说明达到平衡的速度。 达到平衡时的速度是由变性和复性的自由活化能决定。变性活化能不同于天然态和活化态的自由能；复性活化能不同于活化态和变性态的自由能。 失活机理 失活机理 变性条件 1. 凝聚(有时伴随S-S键形成） 热，盐酸胍，脲， SDS，震荡 2. 一级结构改变 3. H+和OH-催化肽键水解，酶水解， 极端pH，热，蛋白酶 自水解 4. 功能基团氧化（SH,吲哚环） 氧化(特别是加热)和它 的代谢物 5. S-S键还原，分子内SH与S-S交换 热，高pH，硫醇，二硫 化物 6. 分子内S-S键再交换 高pH，加热 失活机理 失活机理 变性条件 6. 重要SH修饰 金属离子，二 硫化物 7. 蛋白质磷酸化 蛋白质激酶 8. 催化活性中间物引起的‘自杀失活’ 底物 9. 氨基酸消旋 加热，高pH 10.次级序列形成的S-S键断裂 加热，高pH 11.Asn脱氨 加热，高pH 失活机理 失活机理 变性条件 12. 辅酶从活性中心上解离 螯合剂，硫醇，透析，金属离子， 加热 13. 寡聚蛋白解离成亚基 化学修饰，极端pH，脲，表面 活性剂，高或低温 14. 蛋白质吸附容器表面 小蛋白浓缩，加热 15.‘不可逆’构型变化 加热，极端pH，有机溶剂，盐
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