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遗传学实验报告  拟南芥 T-DNA 插入突变体的鉴定 一、实验目的： 1、学习和掌握基本的植物 DNA 的 CTAB 提取法，掌握 PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能 2、了解 T-DNA 插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。 二、实验原理 1、拟南芥（Arabidopsis thaliana） 十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。 植株形态个体小，高度只有 30cm 左右； 生长周期快，从播种到收获种子一般只需8 周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养； 遗传转化简单，转化效率高； 基因组小，只有 5 对染色体，125MB； 在 2000 年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物 。 2、突变体 突变体是遗传学研究的最重要材料。 突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。 拟南芥诱变常用方法有 EMS 诱变、T-DNA 插入突变、激活标签。 由于 T-DNA 插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的 T-DNA 插入突变体；SALK 中心提供的拟南芥 T-DNA 插入突变体超过十万种。 3、T-DNA 插入突变原理 T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti 质粒中的一段 DNA 序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组 。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA 区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。 除用于转基因以外，T-DNA 插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA 大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。 4、T-DNA 插入突变体 PCR 鉴定 图 1 结果鉴定 图 2 PCR 引物设计 三、实验材料 1、材料：T-DNA 插入的突变拟南芥植株； 2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR 仪，电泳槽等； 3、试剂：液氮，CTAB 提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer， MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。 四、实验步骤 1、植物 DNA 提取方法（CTAB 法） 水浴加热 CTAB 提取液至 65℃ ； 取叶片 100mg, 液氮研磨成粉末； 加入 600μl CTAB 提取液并混匀； 65 ℃水浴 45min（至少 30min）； 5) 12,000rpm 离心 10min； 将上清转移到新离心管，加入等体积氯仿/异戊醇, 混匀； 12,000rpm 离心 5-10min, 将上清液转移到新管中； 向上清中加入 1/10 体积 3M NaAc,再加入预冷的等体积异丙醇或2V 无水乙醇, 混匀冰上放置 10min； 12,000rpm 离心 10min，弃上清，加入 500μl 70％乙醇洗涤 2min； 12,000rpm 离心 5min，弃上清，吸干残留并干燥； 加 20-50 μl TE 缓冲液溶解 DNA。 2、PCR 反应 引物设计 LP: 5’-TCA TCC ACC ATG GAA GAA AAG RP: 5’-TTG GAT ACG ATG CGA GTA AAC BP: 5’- TTG TTC ACG TAG TGG GCC ATC G LP+RP:1107bp BP+RP: 560-860bp PCR 反应体系 H2O: 12.4 μl 10×Buffer: 2 μl dNTP: 0.5 μl MgCl2: 2 μl LP/BP: 0.5 μl RP: 0.5 μl Taq: 0.1 μl DNA: 2 μl Total: 20 μl 3)PCR 温度设定 94℃ 5min 33 cycle 变性：94℃ 30s 退火：53℃ 30s 延伸：72℃ 1min30s 72℃ 7min 3、琼脂糖凝胶电泳分析 1) 500-1000bp：1.2%，Agarose 0.5×TBE； 化胶时应注意不能沸出，冷却至约60℃制胶，凝胶充分冷却凝固后点样进行电泳； PCR 产物加 3-4 μl 6×loading buffer； 120V 稳压电泳； EB 染色 10min，紫外观察。 五、结果分析 PCR 产物电泳截图结果如下图所示。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 图 3 PCR 产物电泳条带图 在图 3，第 7 泳道为 DL 2000 DNA marker，第 5 泳道是 BP-RP 引物体系，第六泳道是 LP-RP引物体系。BP-RP 体系的 PCR 产物产生一条略大于 750bp 的 DNA 条带，而 LP-RP 引物体系中没有在大致 900bp 的位置产生条带。由此，可以断定此样品为纯和突