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现代生物化学实验技术细胞与分子生物学实验室杜 卫第一章 概 述一、生物化学实验技术发展简史 在20世纪，生物科学迅猛发展，其中生物化学与分子生物学的进展尤为迅速。作为一门最具活力和生气的实验科学，在21世纪必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化学与分子生物学实验技术的不断发展和完善。 20年代： 1、微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。2、瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术”，1924年制成了第一台5000×g（5000 r/min～8000 r/min）相对离心力的超离心机，开创了生化物质离心分离的先河，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。 30年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和生物大分子的内部结构。 40年代： 1、英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。2、 瑞典的著名科学家Tisellius建立了“电泳技术”，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。 50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，“放射性同位素示踪技术”在50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。 60年代： 1、各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。 2、1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。 3、1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析仪。4、1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动测定仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。 5、1962年，英国科学家Wilkins通过对DNA分子的X-射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型，与美国科学家Watson和英国科学家Crick共同分享了当年的诺贝尔生理医学奖，他们的研究成果开创了生物科学的历史新纪元。 在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。 在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968~1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。 1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取得了重大进展。 70年代：1、基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶。2、1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。 1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。 80至90年代： 基因工程技术进入辉煌发展的时期。1、1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。 2、1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。 2、1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。 3、1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了PCR技术（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖。 4