大肠杆菌感受态细胞的制备.pptVIP

大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 克隆：通过无性方式，由单个细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一群细胞或生物体。 1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 质粒：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。 2. 相关知识及原理 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的细胞 。 （人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因 ） 载体：是介导小分子物质转运的另一类膜蛋白，它具有特异性。 基因：是具有遗传效应的DNA片段。 转化（transformation）： 是将异源DNA分子导入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 遗传：生命有机体在生殖过程中表现出来的亲子代之间的相似现象。 基因：是具有遗传效应的DNA片段。 转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 载体：是介导小分子物质转运的另一类膜蛋白，它具有特异性。 转化方法的实验原理 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。 电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。 3．仪器、材料和试剂 无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等； 菌株：E.coli jM109 质粒：pUC+DNA 片段的重组质粒 LB培养基； 含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，终浓度100μg／mL ) 氨苄青霉素；母液200mg/ml 预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） 质粒：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。 4．操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从新活化的E.coli E.coli jM109菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右,将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养； （2）每组取培养液1-4ml转入离心管中，在冰上冷却5min(可省略）,5000r／min离心2min （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴30min ； （4） 5000r／min离心2min； （5）弃去上清液，加入400μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 5000r／min离心2min ； （6）弃去上清液，加入200μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，