大肠杆菌基因表达系统.pptVIP

AUG左侧的三个碱基也有影响。 （2）起始密码AUG ?-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 第八章 大肠杆菌基因表达系统 基因：是具有遗传效应的DNA片段。 基因表达：指基因转录及翻译的过程，即生成具有生物学功能产物的过程。 克隆基因的表达： 外源基因在宿主细胞中表达。 外源基因 表达载体 重组载体 导入宿主细胞 在宿主细胞中 表达出蛋白质 提取蛋白 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。 克隆：通过无性方式，由单个细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一群细胞或生物体。 基因：是具有遗传效应的DNA片段。 一、原核表达系统的注意事项 外源基因不能带有内含子。 2. 必须用cDNA或者是化学合成的基因。 3. 不能直接用真核基因组DNA。 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。 内含子：（introns）是真核生物细胞DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中。内含子和外显子的交替排列构成了割裂基因，在前体RNA中的内含子常被称作“间插序列”。 启动子：位于结构基因上游，是RNA聚合酶识别、结合并启动转录的调控序列。 除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件： 1.强启动子、强转录终止子 2.可诱导性 3.合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等 二、理想原核表达载体具备的基本特征 克隆：通过无性方式，由单个细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一群细胞或生物体。 载体：是介导小分子物质转运的另一类膜蛋白，它具有特异性。 A dividing E. coli 原核或噬菌体启动子 MCS SD序列 终止子 启动子：位于结构基因上游，是RNA聚合酶识别、结合并启动转录的调控序列。 ① 必须是一种强启动子 ② 应呈现低水平的基础转录 ③应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。 （1）最佳启动子必须具备的条件 基因工程常用的原核启动子 Plac O 目的基因 乳糖启动子lac 色氨酸启动子trp P1 O trpE 目的基因 cI857: 噬菌体启动子是PL 42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录 cI857 PL 外源基因 28oC时阻遏PL，外源基因不转录。 三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 1. 细胞质中表达 （1）包涵体（inclusion body） 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 形成原理未知。 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 回收的蛋白生物活性差。 ② 缺点 ① 优点 2. 周质中表达 （1）周质（periplasm） 格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。 结构：群落中所有生物及其个体在空间的配置情况 phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase） （3）常用的原核信号肽 ①大肠杆菌的信号肽： 能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。 （2）信号肽（signal peptide） 一般位于N端。 ②金黄色葡萄球菌的蛋白A。 信号肽：分泌蛋白的N端序列，指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，在蛋白合成结束前信号肽被切除。 信号肽：分泌蛋白的N端序列，指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，在蛋白合成结束前信号肽被切除。 鼠源RNase、人生长激素信号肽。 也能在细菌中起作用。 （2）真核信号肽 激素：是内分泌腺或器官组织的内分泌细胞所分泌细胞所分泌，以体液为媒介，在细胞之间递送调节信息的高效能生物活性物质。 用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白； 使表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。 3. 胞外表达 或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。 S-D序列 ATG-外源基因-TAG 优点： 四、几种类型的原核表达载体 1. 非融合型表达载体 缺点： 产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。 载体：是介导小分子物质转运的另一类膜蛋白，它具有特异性。 结构：群落中所有