DB15T 2554-2022发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程.docxVIP

ICS67.080.01CCS ICS 67.080.01 CCS X10 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2554—2022 发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程 Technical regulation for the isolation and identification of Technical regulation for the isolation and identification of probiotic lactic acid bacteria derived from fermented tomato pomace 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。 本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、武晶晶、宋利文、云伏雨、张春华、羿静、康长清。 发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程 范围 本文件规定了发酵番茄渣中益生性乳酸菌分离与鉴定的规范性引用文件、术语与定义、材料及操作规程等技术要求与规范。 本文件适用于发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.35 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 下列术语和定义适用于本文件。 益生性乳酸菌 lactic acid bacteria (LAB） 能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸、无芽孢且具有益生性能的革兰氏染色阳性细菌的总称。 发酵番茄渣 tomato pomace 生产番茄酱(汁)后的番茄渣（主要由果皮、种子和少量的残余果肉组成）经微生物发酵后的产物。 序列比对 sequence alignment 为确定两个或多个序列之间的相似性或同源性，而将它们按照一定的规律排列，检测序列之间的相似性，从而发现生物序列中的功能、结构和进化信息的一种生物信息学方法。 进化树 evolutionary trees 通过系统发育分析所推断出来的进化关系一般用分枝图表即进化树来描述，这个进化树就描述了同一谱系的进化关系，包括了分子进化、物种进化以及分子进化和物种进化的综合。 4 材 料 番茄渣来源 来自工厂的新鲜番茄渣。 发酵番茄渣的制备与保存 每个聚乙烯塑料袋中称取100 g番茄渣，用真空包装机抽成真空并封口。每个处理设3个重复，于户外进行为期30 d、 60 d和90 d的厌氧发酵，在第30 d、60 d和90 d分别取样，将样品装在无菌袋中， 放入冰盒带回实验室尽快进行乳酸菌的分离。 5 操作规程 菌株和细胞 菌株 指示菌：致病性的大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。 试验菌：从发酵番茄渣中分离出的乳酸菌。 细胞 Caco-2细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。 仪器设备 电子天平（感量0.01 g），超纯水系统，高压蒸汽灭菌锅（137 ℃，0.25 MPa），超低温冰箱（- 50 ℃～-86 ℃），恒温摇床，恒温培养箱，厌氧培养箱，普通离心机，紫外分光光度计，涡旋振荡仪， 倒置荧光显微镜（40 x～640 x），pH计，PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，低温高速离心机（20000 g， 8 ℃～10 ℃）。 试剂与耗材 试剂 MRS琼脂培养基，MRS肉汤，MEM培养液，脑心浸出液培养基，细菌基因组DNA提取试剂盒，Agarose Gel DNA Extraction Kit，EcoT14 digest DNA Marker，DL2000 DNA Marker，Taq DNA聚合酶，琼脂糖，胎牛血清，青链霉素双抗，PBS缓冲液，胃蛋白酶，胰蛋白酶，胆盐，甘油、过氧化氢、氯化钠、浓盐酸、巯基乙酸钠、丙酮酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、甲醇等均为分析纯。 耗材 T25细胞培养瓶，6孔细胞培养板，90 mm培养皿，15 mL/50 mL离心管，500 mL/250 mL锥形瓶，0.22 μM滤膜，牛津杯，加样器，棉拭子等。 溶液配制 见附录A。 乳酸菌的分离、纯化和保藏 乳酸菌的分离 称取10.0