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《血红蛋白的提取和分离》课件会计学第1页/共59页第2页/共59页 血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。第3页/共59页一、基础知识:学生活动1:1 、分离生物大分子的基本思路是什么？2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？3 、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？4 、为什么不用鸡的血红细胞而用人的血红细胞作为实验材料？5 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质 ？凝胶色谱法 提取分离方法凝胶电泳法 第4页/共59页一、基础知识--蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。 第5页/共59页(一)凝胶色谱法（1）原理：（2）材料大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 收 集大分子收 集小分子 混合物上 柱洗脱大分子流动快小分子流动慢第6页/共59页（3）分离过程 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 第7页/共59页(一)凝胶色谱法第8页/共59页学生活动2: 1、什么是凝胶？ 2、什么是凝胶色谱法？3、凝胶色谱法的原理是什么？4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离相对分子质量不同蛋白质的具体过程。第9页/共59页第10页/共59页（二）、缓冲溶液学生活动3:1 、什么是缓冲液？2、 缓冲液的作用是什么？3、 缓冲液是如何配制的？你所学过的人体血液的缓冲物质有哪些？4、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？第11页/共59页（二）、缓冲溶液缓冲溶液－－洗脱剂组成：配制：作用：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。第12页/共59页（三）、电泳学生活动4:1 、什么是电泳？2、 影响电泳迁移速度的因素有哪些？3、 如何消除电荷对电泳迁移速度的影响？4、电泳分离各种分子的原理是什么？ 5 、请描述电泳的过程？第13页/共59页(三)电泳1.电泳的概念指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.2．凝胶电泳法：（1）原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素第14页/共59页影响蛋白质分子运动速度的因素?决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√第15页/共59页(三)电泳（2）分离方法：（3）分离过程： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 琼脂糖凝胶电泳第16页/共59页电泳检测结果第17页/共59页二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。第18页/共59页（一）样品处理1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。 血液组成成分 样品处理1.洗 涤 红 细 胞 粗 分 离2.释放血红蛋白 纯 化3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白纯度鉴定第19页/共59页二、实验操作跳转红细胞血浆血细胞血红蛋白2条β-肽链 2条α-肽链亚铁血红素第20页/共59页血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机化合物是_____________。该化合物是由 _____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的___________基团。返回吸出血浆5倍体积生理盐水3g柠檬酸钠血 浆低速离心2 min红细胞红细胞搅拌10min第21页/共59页1.洗 涤 红 细 胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤过程：血液100mL重复洗