核酸分子杂交技术.pptVIP

二、Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA 第三十页，共五十三页，2022年，8月28日 Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA 第三十一页，共五十三页，2022年，8月28日 三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量 第三十二页，共五十三页，2022年，8月28日 四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交 第三十三页，共五十三页，2022年，8月28日 保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定 2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： 第三十四页，共五十三页，2022年，8月28日 （2）组织细胞杂交前的预处理 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落 第三十五页，共五十三页，2022年，8月28日 （3）探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察 第三十六页，共五十三页，2022年，8月28日 （4）杂交 杂交液体积小：10~20μl cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变性 冲洗温度一般 不超过50 ℃ 第三十七页，共五十三页，2022年，8月28日 （5）杂交结果检测 所用探针为核素标记,放射自显影检测 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测 第三十八页，共五十三页，2022年，8月28日 第一页，共五十三页，2022年，8月28日 变性 复性 DNA-DNA 杂交双链分子 第二页，共五十三页，2022年，8月28日 一、DNA变性与复性 （一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性 第三页，共五十三页，2022年，8月28日 2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。 第四页，共五十三页，2022年，8月28日 3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加 第五页，共五十三页，2022年，8月28日 4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线 第六页，共五十三页，2022年，8月28日 5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3 第七页，共五十三页，2022年，8月28日 （二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单