分子生物学实验技术：感受态细胞的制备.pdfVIP

感受态细胞的制备 【实验目的】 掌握感受态细胞制备的基本原理。 【实验原理】 经体外重组后的DNA分子，必须经过一定的方式导入宿主细胞，通过宿主 细胞的复制而使 目的基因得到大量的扩增。宿主细胞也称受体细胞,分为原 核细胞和真核细胞两类。原核细胞包括大场埃希菌、枯草杆菌、链霉菌等，其 中以大肠埃希菌为主；真核细胞包括酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等。 细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态幻胞 （competent cell） .将细菌置于0*C低渗CaCl2溶液中时，菌细胞壁和 的通透性增 强，菌体膨胀成球形。外源DNA与形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于 细胞表面，再经42P短暂的热冲击处理（热休克）后能促进细胞吸收外源DNA复合 物。然后在营养丰富的培养基上生长1 h左右后，球状菌纽胞复原，转化子中的抗性 基因也得以表达。随后将菌液涂布于含抗生素的选择性培养基平板上，转化子可分 裂、增殖形成菌落。 【实验试剂】 （1） 1 mol/L CaCl2 :在 200 ml 去离子水中溶解 54 g CaCl2 - 6HQ,用 0. 22 pm 滤器过滤除菌，分装成10 ml小份贮存于一2（TC下。 （2） 0. 1 mol/L CaCl2 :制备感受细胞时，取出1 mol/L CaCl2 一小份解冻并用去 离子水稀释至100 ml,用0. 45 的滤 过滤除菌，然后骤冷至（TC。 （3） 10%甘油：高压灭菌后贮存于4P下备用。 （4） L 液体培养基。 【实验器材】 （1） 冰箱。 （2） 制冰机。 （3） 超洁净工作台。 （4） 电子天平。 （5） 高压灭菌锅。 （6） 微量加样器。 （7） Eppendorf 管（EP 管）。 （8） 0. 22ptm 滤 。 （9） 0. 45 ptm 滤 。 （10） 各神规格量筒。 （11） 冰盒。 （12） L 平板。 【实验样本】 大肠埃希菌。 【搜作步骤】 （-）受体菌的培养 （1） 将甘油贮存的受体菌在L 平板上划线,371下培养16〜20 h° （2） 从L 平板上挑取2〜3 mm大小的单菌落接种于1 ml L 液体培养基中， 37P下振摇过夜。 （3） 取上述菌液200〜300 pl转入50 ml L 液体培养基中,37*C下300 r/min,强 烈振荡培养2. 5-3 h,使细胞的浓度达5X 107个/ml。此时细菌的A22一般为0. 2〜 0. 4（为对数生长期或对数生长前期）。 （二）感受态佃胞的制备（CaCl?法） （1）收集菌体。将上述培养的菌液冰上放置10 min,然后转移到适宜的EP管 中，4C下离心 4 000 r/minX 10 mino 2 ）弃上清液，将EP管倒置于吸水纸上,使剩余的液体流尽。 （3） 加入10 ml预冷的0. 1 mol/L CaCl2使沉淀轻轻悬浮，然后冰浴15 min.此 时为感受态细胞。 （4） 若不立即转化，可做如下处理保存备用。将上述菌液4P下离心4 000 r/minX 13 min,弃上清液，每50 ml的原培养物加入2 ml冰预冷的0. 1 mol/L CaCl2溶液， 再加终浓度为10% 的灭菌甘油，按每份200 M分装在EP管中，置于一701下 冻贮。 【注意事项】 （1）制备感受态细胞前的受体菌应处于对数生长期。峙化时菌浓度应控制在不 超过107个/ml,过浓说明菌体生长已过了对数生长期;过稀则菌数太少，这段时间只 有1%〜10% 的菌能成为感受态。 （2） 为了提高转化率，最好将配制好的0.1 mol/L CaCl2致敏缓冲液避光贮存于 4*C冰箱。此外,CaCl2必须为分析纯。 （3） 感受态细胞可以在一701下保存，但贮存时间过长将导致转化率下降 般环化重组子分子越小转