生物显微技术课件.pptxVIP

石蜡切片的制作;石蜡切片的过程;一、动物的处死;二、动物组织取材;三、固定;灌注式;3、固定液;醛类固定剂;非醛类固定剂;丙酮及醇类固定剂;混合固定剂;4%多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4 成分： 4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中， 1倍的磷酸缓冲液:PBS MV NaCl 140mM 58.44 KCl 2.7mM 74.55 NaH2PO4?12H2O， 10mM 358.14 KH2PO4 1.8mM 136.09 调pH至7.4。 ;Bouin’s液;固定组织时应注意： ①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 ②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。 ③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。 ;固定时间的选择;组织固定后的处理;四、脱水; 乙醇：最常用的脱水剂 一般组织：70%---80%----90%--100%--- 100% 特殊组织：30%--40--%--50%---60%---70%--- 80%---90%--100%--- 100% 每步30分钟左右。 要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间 不能过度脱水（使组织变脆） 不同组织脱水时间不同： 大的致密的组织需要延长脱水时间 为加速各级酒精的穿透力，脱水可 在37℃温箱中进行。 ;五、透明或媒浸;六、包埋;石蜡包埋;;;七 石蜡切片;;火棉胶切片法;;冰冻切片法 ;染色 ;;苏木精(hematoxylin)、伊红（eosin）染色法（ＨＥ染色） ;Delafield 苏木精液;石蜡切片苏木精染色步骤;;ＨＥ染色结果;; 组织化学;定义;;组织化学的技术要求;组织化学的特点;研究内容;糖类显示; ;核酸显示;分类;酶类的显色方法;酶的组织化学反应;;碱性磷酸酶钙-钴显示法;碱性磷酸酶作用液(pH9．3) 溶液1：2％甘油磷酸纳 2％巴比妥纳 2％硝酸钙 2％硫酸镁(或氯化镁) 蒸馏水 溶液2： 1％硝酸钙。 溶液3： 1％硝酸钻。 溶液4： 1％硫化铵(临用时现配) ;方法;免疫组织化学;免疫组织化学Immunocytochemistry ICC;免疫组织化学;免疫细化学的基本理论;抗原抗体反应;;免疫组织化学特点;基本技术方法;免疫组织化学分类;免疫酶细胞化学;酶的种类;酶的要求;基本步骤;抗体制备;酶桥法;抗过氧化物酶法（ PAP ）;PAP法的评价 ;亲和免疫细胞化学技术;亲和免疫细胞化学技术特点; 抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法 ;抗生物素—生物素染色法 ;桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术） ;;操作步骤;标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术） ;;;设计对照实验;阳性对照 ;阴性对照 ;免疫细胞化学结果的判断 ;免疫组化检测action蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。请选择抗体组合，设计实验。 人抗大鼠action（同种型IgG ） 大鼠抗人action （同种型IgG ） 兔抗大鼠action （同种型IgG ） 生物素标记的兔抗人IgG 生物素标记的兔抗人IgM 生物素标记的人抗兔IgG 生物素标记的人抗兔IgM 碱性磷酸酶标记的卵白素 碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG ;原位杂交组织化学 ;核酸分子杂交技术 ;;定义： 特定标记的已知序列的核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对标记的探针进行检测的方法称为原位杂交。 ;;分类;原理;;优点 ;应用;;;原位杂交流程;;缺刻平移法标记DNA探针DNA Nick translation ;DNA Random primed labeling ;RNA probe labeling ;原位杂交条件的选择;增强组织的通透性和核酸探针的穿透性;杂交;Tm＝79．8一D十0.584×％GC十16×lg[Na＋]一F×(％formamine)一L D：是用来校正各种不同类型杂交体热稳定性的差别系数。DNA：DNA 10 DNA：RNA 5