电压钳制和膜片钳制技术.pptVIP

一 基本原理 膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 第三十一页，共七十七页，2022年，8月28日 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。 第三十二页，共七十七页，2022年，8月28日 膜片钳与电压钳的区别 膜电位钳制的方法不同； 电位固定的细胞面积不同； 研究的离子通道数目不同； 第三十三页，共七十七页，2022年，8月28日 (1)测量部分： (2)串联电阻补偿部分： (3)电容补偿部分： (4)指令信号控制部分： (5)电源部分： 膜片钳放大器主要组成: 电极电流监视器、灵敏度开关、滤波器开关、方式选择开关 。 用于校正全细胞记录时，由于电极和细胞内之间的通路电阻所造成的膜电位误差 。 用来补偿电压突然改变 时引起的电容电流 。 将一定的电压加入到刺激信号中，形成一指令信号的保持电压。进行电压钳制时，它决定膜电位值，作电流钳制时，则决定电流值 。 提供放大器各部分的电源 。 第三十四页，共七十七页，2022年，8月28日 贴附式 全细胞记录模式 负压吸 内面向外式 外面向外式 拉 细胞 细胞 细胞 细胞 拉并暴露于空气中 四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode) 第三十五页，共七十七页，2022年，8月28日 第三十六页，共七十七页，2022年，8月28日 细胞贴附式膜片（cell-attached patch） 优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。 缺点： 不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。 于细胞牢固贴附于微管电极的尖由端而得名。它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。 第三十七页，共七十七页，2022年，8月28日 贴附式记录（ Cell-attached recording） 细胞 电极 细胞膜 胞外液 胞内液 第三十八页，共七十七页，2022年，8月28日 内面向外式膜片 (inside-out patch) 细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。 特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。 应用：可研究胞内信使物质cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。 第三十九页，共七十七页，2022年，8月28日 内面向外记录（Inside-out recording） 电极 脂质双分子层的内面面向浴液 第四十页，共七十七页，2022年，8月28日 外面向外式膜片(outside out patch) 细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。 优点： 缺点： 应用： 可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。 实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。 可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等对受体型的离子通道研究。 第四十一页，共七十七页，2022年，8月28日 外面向外记录（Outside-out recording） Patch-pipette 脂