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会计学1IPTG诱导的外源蛋白表达 1. 课题来源：实验步骤： 接种 扩大培养 IPTG诱导 蛋白提取、纯化思考： IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用原理？第1页/共26页 2. IPTG的作用原理IPTG (isopropylthiog- alactoside,异丙基硫代半乳糖苷): 化学合成的乳糖类似物，很强的β －半乳糖苷酶诱导剂，诱导乳糖操纵元(lac operon)的开放，自身不被催化分解。类似的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 β－半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。第2页/共26页 2. IPTG的作用原理第3页/共26页 2.1 乳糖操纵元（lac operon）大肠杆菌利用乳糖至少需要需要两个酶：促使乳糖进入细菌的乳糖透过酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的β －半乳糖苷酶(β -galactosidase)。在环境中没有乳糖或其他β-半乳糖苷时，大肠杆菌合成β-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖或其类似物2-3分钟后，细菌大量合成β -半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的β-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。第4页/共26页 2.1 乳糖操纵元（lac operon）乳糖操纵元含有ｚ、ｙ和ａ3个结构基因。ｚ基因表达产物为β -半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖；ｙ基因编码半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；ａ基因编码转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。第5页/共26页 2.1 乳糖操纵元（lac operon）第6页/共26页 2.1 乳糖操纵元（lac operon）ｚ基因5’侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（ribosome binding site，RBS）特征的Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。第7页/共26页 由于ｚ、ｙ、ａ三个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。 2.1 乳糖操纵元（lac operon）第8页/共26页 2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控操纵子（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。在乳糖操纵元中，调控基因lac I位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。第9页/共26页 2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控第10页/共26页 2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵元处于阻遏状态。此ｉ基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子ｏ结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动，从而阻遏了这群基因的表达。第11页/共26页 2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控第12页/共26页 2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类，β－半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵元的诱导作用。 第13页/共26页 2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控 在这过程中乳糖（实际起作用的是别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去阻遏作用（derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放第14页/共26页 2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。第15页/共26页 2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP（cA