项目一核酸的生产精讲.pptxVIP

会计学;第一章 概述;核酸的化学组成;核酸的水解产物：;核酸的生理功能;第二章 核酸的制备和应用;核酸制备的基本步骤;核酸分离纯化的一般原则;核酸的提取、分离纯化;核酸含量的测定方法及原理;2.定磷法 核酸分子结构含有一定比例的磷（RNA的含磷量约8.5%~9.0%，DNA含磷量约9.2%）测定其含磷量即可求出核酸的量。 核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下，无机磷与钼酸铵结合成黄色磷钼酸铵沉淀，当有还原剂存在时，Mo从+6被还原为+4价，+4价的Mo再与试剂中的其他MoO4结合成Mo(MoO)2或Mo3O8,呈蓝黑色，称为钼蓝。 在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需做对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。;3．定糖法 （1）地衣酚显色法测定RNA含量: RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的核糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3,5—二羟基甲苯（地衣酚，苔黑酚）反应形成绿色复合物，该产物在670nm处有最大吸收值。当RNA浓度为20~250μg/ml时，光密度与RNA度成正比。 ;（2）二苯胺法测定DNA含量 DNA分子中有2—脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2—脱氧核糖并形成ω－羟基－?－酮基戊醛，后者与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40~400μg范围内时，光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。 ;第三章 RNA和DNA的提取及测定;制取方法 ;RNA地衣酚显色测定标准曲线的制作：去12支烘干试管，按下表编号及加入试剂。平行做两份。毕置沸水浴加热25分钟，取出冷却，以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值，以RNA浓度为横坐标，光吸收为纵坐标作图，绘制标准曲线。 ;3）、样品的测定?取2支试管，各加入2.0?ml样品液，再加2.0?ml地衣酚—Cu2+试剂，如前述进行测定。 4）、RNA含量的计算根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量： 待测液中测得的RNA含量（μg/mL）*100% RNA%=待测液中制品的含量（μg/mL） ;二、DNA的提取和含???测定;操作流程;5）次日将所得的半透明粘稠状液体连续注入预冷的11倍体积（1320mL）蒸馏水中，轻轻摇匀，DNP（脱氧核糖核蛋白）即呈絮状沉淀析出，置于冰箱内放置数小时。 6）上层清夜利用虹吸法析出，剩余含有沉淀的少量溶液经离心（3000r/min,10min）,收集DNP沉淀。 7）将DNP沉淀再溶于原组织重约4倍体积（80mL）的10%NaCl溶液中，轻轻搅拌加速溶解。 8)加入1/2体积的氯仿-异戊醇溶液40mL，上下剧烈震荡10min，使组蛋白分离，于3000r/min，离心10min。析出上面含有DNA和DNP的水层，弃去两层间的变性蛋白凝胶，回收下层有机相。 ;9）上层水再次加入20mL氯仿-异戊醇混合液，继续抽提取出蛋白质，多次重复操作直至两相之间无明显变性蛋白质凝胶生成。 10）最后吸出上清液并将它连续注入体积预冷至4°C的95%乙醇中。 11）用玻璃棒小心捞出纤维状DNA钠盐沉淀，沥干乙醇溶液后，依次用80%~95%乙醇洗涤，最后用少量无水乙醇洗涤，轻轻压挤沉淀，尽量吸尽乙醇后，铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，即得白色纤维状的DNA钠盐。 ;二、DNA含量的测定 1）标准曲线的制定 取14只试管，分成7组按下表操作 ;每组取两管光吸收平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 2）样品的测定 取2支试管各加入2mL待测液和4mL二苯胺试剂，其余操作同标准曲线的制作， 3）DNA含量的测定 根据测得的光吸收值从标准曲线上查出相当的DNA含量： 待测液中测得的DNA微克数*100% DNA%= 待测液中制品的微克数 4）DNA的纯化：密度梯度离心法、柱层析法和凝胶电泳法 ;谢谢观看