重组DNA技术之表达系统.pptVIP

（三）哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统，是目前应用最广泛的动物细胞表达系统。其优点和缺点都极其显著。产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。 第六十二页，共一百二十一页。 但该表达系统的表达水平较低、培养基昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞表达系统通常用来生产用常规方法无法获得的真核细胞蛋白。如EPO，TNF受体，基因工程单抗等。 CHO（中国仓鼠卵巢）是目前重组糖蛋白生产的首选体系。 第六十三页，共一百二十一页。 载体： 1、病毒性载体系统，包括逆转录病毒载体及其它DNA病毒载体。 优点：能够高效导入外源基因。 缺点：包装时对其基因组的长度有严格的限制，插入外源基因一般较短。 2、质粒性载体系统。 优点：适用于多种细胞；安全。 缺点：导入外源基因的效率不如逆转录病毒。 第六十四页，共一百二十一页。 商品化系统： ViraPower?慢病毒表达系统，是第一次实现在不分裂的哺乳动物细胞中进行稳定的高水平基因表达。 Adeno-X? 表达系统－最有效的腺病毒系统之一。BD Adeno-X? Expression System (Clontech)可以在2周内获得高效价的腺病毒，其效率远高于其他腺病毒系统。 BD Adeno-X? Tet-On? Adeno-X? Tet-Off? Expression Systems (Clontech) 可表达毒性蛋白质。BD RevTet-On? RevTet-Off? Gene Expression Systems (Clontech) 表达效率高。 第六十五页，共一百二十一页。 新霉素抗性选择系统 新霉素是细菌抗生素，它可以干扰原核生物的核糖体，使其蛋白质合成不能正常进行，而真核细胞核糖体则不受新霉索的影响。新霉素的一种类似物G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞均有毒性。 第六十六页，共一百二十一页。 细菌的新霉素抗性基因(neor)能在真核细胞表达。neor基因编码一种磷酸转移酶，这种酶能使G418失活。所以，当细胞表达了这种neo抗性基因后就会在含有G418的选择培养基中存活，这种选择系统适用于所有的细胞类型。 第六十七页，共一百二十一页。 外源基因导入哺乳动物细胞 目的基因序列与载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能获得重组DNA分子克隆，不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。 第六十八页，共一百二十一页。 转染方法 （一）质粒为载体的物理化学转染法 （二）以病毒为载体的生物学转染法 第六十九页，共一百二十一页。 磷酸钙法 其利用的基本现象是：DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时，培养细胞摄取DNA的效率会显著提高。用电穿孔法处理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取DNA能力，但所用外加电场的强度、电脉冲的长度等条件与处理细菌者都很不相同。 第七十页，共一百二十一页。 脂质体 近年来用人工脂质膜包裹DNA，形成的脂质体（Liposome）可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞，方法简单而有效，现有商售的脂质体试剂，使用日益广泛。 第七十一页，共一百二十一页。 显微注射法 是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。 第七十二页，共一百二十一页。 电穿孔转染法（electroporation） 用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率。 第七十三页，共一百二十一页。 以病毒为载体的生物学转染法 将目的基因插入病毒载体，在病毒调控元件作用下进行表达。作为运载工具的病毒有SV40，人腺病毒，牛乳头瘤病毒，逆转录病毒等。 第七十四页，共一百二十一页。 外源基因在真核细胞中的表达方式 常用的表达方式有两大类： 1、瞬时表达 2、稳定表达系统 第七十五页，共一百二十一页。 瞬时表达系统 瞬时表达的效率取决于吸收DNA的细胞数、基因拷贝数和基因的表达水平，在瞬时表达系统中，吸收DNA的细胞数约为5%~50%。因为没有整合，随着细胞的生长，细胞群体中外源基因的含量逐步减少，最后消失。因此瞬时表达系统只能使用数天。 第七十六页，共一百二十一页。 瞬时表达常用于下列方面：①根据表达活性确证分离到的基因；②研究诱变对蛋白