【教学指南】电泳技术.pdfVIP

电泳技术 （一）原 理 1、电泳、迁移率 电泳（Electrophoresis ）是指溶液中带电粒子在电场中向带相反电荷的电极方向移动的 现象。在生物科学中，电泳技术广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。 因为带电粒子的移动速度和电场强度有密切关系，所以为了表示不同物质有不同泳动速 度的特性，通常使用“迁移率” （Mobility ）的概念。带电粒子在电泳时的迁移率，就是指在 V 单位电场强度下粒子的移动速度（ ）。 X 2、影响迁移率的因素 在电泳过程中，带电粒子的移动速度v 除与粒子所带电荷量Q 及电场强度X 有关外， 还与粒子半径r 及介质的粘度 有关： η QX v π6ηr 式中6 π是适用于球形带电粒子的经验数值，对椭圆形或半径很大的粒子则数值有所不 同。可见，带电粒子的移动速度和粒子的本身的性质有密切关系，粒子表面所带电荷量和物 质的组成结构有密切关系。此外，粒子的大小（分子量）及粒子的形状等也有重要的影响。 所以，在一定电场强度下，不同种类的带电物质在电泳时的移动速度就不能完全一致，这种 移动速度的差异就是电泳技术的基本依据。 （１）样品 带电化合物的性质在几个方面影响着它们的迁移率。 （1）电荷：迁移率随净电荷的增加而增加。电荷的大小一般由pH 决定。 （2 ）分子大小：对于较大的分子，由于周围介质所引起的摩擦力和静电力的增加，迁 移率下降。 （3 ）形状：同样大小的，但是具有不同形状的分子，如纤维状的蛋白质和球状蛋白质， 因摩擦力作用不同，而表现有不同的迁移特征。 （２）电场 欧姆定律表示了电流A （安培）、电压V （伏特）和电阻Ω （欧姆）之间的关系：A ＝V ／Ω。因此，离子在电场中的分离受到这三个因素的影响。 （1）电流：由于在二个电极之间溶液中的电流完全由缓冲液和样品的离子来传导，因 此，迁移率与电流成正比。离子迁移的距离与通电时间成正比。因此，为了得到最好的重复 性，在电泳时电流必须保持恒定。当然必须使用直流电。 （2 ）电压：电压控制着电流，因此，迁移率与加在支持介质两端的电位差成正比。这 是电压梯度，一般用伏特／厘米（V/cm ）来表示（即，所加的电压除以支持介质的长度）。 可以使用低电压（100－500 伏），或者高电压（500 －10,000 伏），电压梯度分别可达20 和 200 伏／厘米。高电压主要是用于分离小分子的化合物。 （3 ）电阻：迁移率与电阻成反比，电阻由支持介质的类型和大小，以及缓冲液的离子 强度所决定。电阻随支持介质的长度而增加，随支持介质的宽度和缓冲液离子强度的增加而 降低。 在电泳时以A2Ω瓦特的比率产生热，并且电阻随温度升高而下降。因此，如果电压保持 不变，那么这种温度的升高将会引起电流的升高，并且促使了支持介质上溶剂的蒸发。为了 尽可能得到可重复的结果，使用经过稳定的电源装置，尽管由于温度的波动，不可避免地会 引起电阻的改变，但是这种电源能自动地保持电压或者电流的恒定。用一个密闭的盖子罩住 电泳槽以减少蒸发。在电泳槽中附设一个冷却系统，在高压工作时起到外加冷却的作用。 （３）缓冲液 缓冲液决定着并稳定着支持介质的pH ，并且通过很多途径也影响着化合物的迁移率。 （1）成分：通常所用的缓冲液是甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、巴比妥盐和磷酸盐、Tris、 EDTA 和吡啶。硼酸缓冲液经常用于碳水化合物的分离，因为它们能和碳水化合物产生带电 的复合物。 因为缓冲液是样品的溶剂，因此，不可避免的会有一定强度的样品扩散。特别值得注意 的是像氨基酸和糖一类的小分子。让样品走成很窄的带，避免过量的加样；在一个尽可能短 的时间内使用高电压；以及在分离完成后迅速地取出并干燥等都能缩小扩散的适度。 （2 ）浓度：由于缓冲液离子强度的增加，缓冲液所载的分电流也随之增加，样品所载 的电流则降低，因此而减