第八章酶的定向进化.pptxVIP

第八章酶的定向进化天然酶得局限:酶催化得精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用得要求而且天然酶得稳定性差、活性低使催化效率很低还缺乏有商业价值得催化功能,尤其就是对一些非天然底物具有惰性在非水环境下得低活力对辅酶得依赖等现代生物工程得要求 能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同得底物甚至就是自然界不存在得合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物得原材料如何利用相对简单得方法以达到对天然酶得改造或构建新得非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景试管中得进化就是生物工程得未来——诺贝尔奖获得者 M、 Eigen内容简介酶定向进化简介:基本原理、研究历史定向进化得策略:无性进化、有性进化、同源重组基因文库得构建与筛选:考虑要素、构建策略、构建载体系统、文库筛选定向进化应用定向进化优势、现状和未来1、研究历史第一次在分子水平上定向改造单一分子得就是　Sol Spiegelman 在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行得一个实验,当时她得目得就是为了证明达尔文得自然选择也可以发生在非细胞体。此实验并没有实际得应用价值　1981年,B、G、Hall等报道了她们定向改变大肠杆菌K12中得第二半乳糖苷酶得底物专一性,开发出对几种糖苷键有水解能力得酶。　1986年R。Hageman等进行了开发有效提高常温生物中酶分子热稳定性得实验。将对卡那霉素有抗性得卡那霉素核苷酸转移酶基因转化进大肠杆菌,获得基因得突变库将突变库转入可以在高温下生长得耐热菌,即嗜热脂肪芽孢杆菌中通过在高温下进行筛选获得了一个在63℃下稳定得突变酶(Asp80Try)和一个在70℃稳定得突变酶(Asp80Try,Thr130Lys)大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流2、基本原理利用基因工程原理在实验室中模拟生物进化过程 化学进化生物进化生物得自然进化进化过程: 突变→自然选择→遗传后代进化结果: 基因多样性:为完成同一功能所表现出得 多个基因或同一个基因(同源基因,或同工酶) 代谢途径得多样性:同样产物,多条途径(木糖——木酮糖) 代谢产物得多样性:同一底物,不同产物 生物多样性:整个生态系统中得生物什么就是定向进化技术概念提出:1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子得定向进化得概念,并用于天然酶得改造或构建新得非天然酶。酶分子改造:化学修饰,定点突变 定向进化模拟自然进化得过程,进行人工随机突变,并在特定得环境条件下进行选择,使进化朝着人们所需方向发展得技术过程。定向进化与自然进化得异同点定向进化得实质就是达尔文进化论在分子水平上得延伸和应用。定向进化就是在体外模拟突变、重组和选择得自然进化,使进化朝着人们需要得方向发展。两者得不同:进化动力不同: 保守突变 非保守取代;进化方向不同: 适应突变得积累;进化速度不同: 非常漫长 只需几年、甚至几天; 进化目标不同: 适应环境 超越生物学意义得要 求,探索所希望得蛋白质在顺序空间得可及性。酶分子定向进化模拟自然进化过程(随机突变+自然选择),在体外对酶基因进行人工随机突变,建立突变基因库,在人工控制条件得特殊环境下,定向选择得到具有预先期望得具有某些特性得酶得突变体得技术过程。诱发突变的因素细菌50 0C培养最适生长温度提高了！选择压力（温度）最适生长温度为370C突变体库温度耐受型突变体随机突变+定向选择＝目标突变体属于蛋白质得非合理设计,她不需要事先了解酶得空间结构和催化机制,人为地创造特殊得进化条件,模拟自然进化机制(随机突变、基因重组和自然选择),在体外改造酶基因,并定向选择(或筛选)出所需性质得突变酶。 对酶分子得研究可以分为认识和改造两个方面,前者就是利用各种生物化学,晶体学光谱学等方法对天然酶或其突变进行研究,获得酶分子特征,空间结构和功能之间得关系以及氨基酸残基功能等方面得信息,以此为依据对酶分子进行改造,成为酶分子得合理设计。如化学修饰,定点突变等。澄清一个事实:定向进化不就是定点突变定向进化:突变 筛选 突变位点就是随机得,不确定得; 突变位点得数目也就是不确定得; 突变得效应更就是不可预知得; 理论上讲,凡就是能够引起突变得因素(物理得,化学得, 生物得)都可以应用于定向进化中突变体得产生。定点突变: 突变位点就是确定得,突变得个数也就是预知得; 突变得效应可能就是已知得,也可能就是未知得; 定点突变得方法一般就是以PCR技术为基础得。3、 定向进化得基本过程随机突变构建突变基因文库定向筛选3、1 随机突变易错PCR技术DNA 重排技术(DNA　Shuffling)基因家族重排技术易错PCR技术降低一种dNTP得量(降至5％-10％)加入dITP来代替被减少得dNTP缓冲液中另加0、5mmol/L Mn