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基因工程主要技术原理序列分析2、3、1 Sanger双脱氧链终止法■ 2、3、2 Maxam－Gilbert化学修饰法■ 2、3、3 序列分析自动化■2、3、4 杂交测序■2、3、5DNA策序的商业运作及存在问题■2、3、6 考虑问题■2、5、1 Sanger双脱氧链终止法DNA核酸序列分析历程60年代末就已掌握了充分的理论知识,只是当时在某些技术能力上和研究思路上,存在着弱点,阻碍了从理论转变为现实。第一,如何分离寡核苷酸片段;另一方面,在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965,Cornall大学以S、W、Holle,为首的科学家小组,首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸,经分离纯化后,再分别测定短片段顺序。返回引物—延伸测序策略1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士(Dr、Ray Wu) 独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略,并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列;1977,F、Sanger在该策略的基础上,发展出了快速测定DNA序列的末端中止法;K、 Mullis采纳他的方法,完善了PCR扩增DNA的方法;M、Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。2、5、1 、1 Sanger双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性:1、利用单链DNA模板,合成DNA互补链;2、利用2’,3’双脱氧核苷三磷酸作底物,参入到寡核酸链的末端,从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法,或酶催引物合成法。反应:同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及 四种dNTP(有一种带放射性标记)。变性胶电泳分离反应混合物。放射自显影术,检测单链DNA片段的放射性带。结果判读,从放射性X光底片上,直接读出DNA的核酸顺序。考考您:反应混合物中,标记什么最方便？ddATPddTTPddGTPddCTP考考您GTACGTTGACGCCddCTP ddATP ddGTP ddTTPAGTCAGGATCACC酶、原料比例在实际的DNA合成反应中,使用失去了5’ →3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。适当地调整ddNTP和dNTP的比例,便能够获得良好的电泳谱带模式。dNTP／ddNTP=1:100时,谱带分离效果较佳,可读出多于 200个以上的核苷酸顺序。降低ddNTP对dNTP浓度比,会产生逐渐加长的片段,再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶,分辨能力可提高到能判读出300个左右的核苷酸顺序。dNTP／ddNTP与良好的电泳谱带模式的关系如何？2、5、1、2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷分析:如此处理后,能策得高分子量DNA不？高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段,然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化,从胶中抽取DNA片段,供进一步分析。为了将这些降解的DNA片段,按其原来的顺序“拼排”起来,至少还需要用一种或数种其它内切限制酶,对同种DNA作酶切消化,并进行电泳纯化和序列分析。实际上可行不？这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。费时费钱,因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段,就需要制备足多数量的DNA,而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中,会加剧DNA的损伤和丢失。克服缺点的一种途径—DNA分子克隆将不同限制酶消化切割的DNA限制片段,随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体,例如 M13作为载体,重组体噬菌体的DNA分子,可直接用作模板。引物:合成的特定的寡核苷酸,或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物” 。M13载体克隆DNA片段将DNA片段克隆在M13mp载体特定位点上,即位于 Lac区段中含有多克隆位点的多聚衔接物(polylinker)内。重组体噬菌体,在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑,而非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体,并制备出单链DNA,就能够直接按双脱氧链终止法进行序列分析。当然这种随机的方法,也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来,恢复成原来结构形式的总DNA序列。使用M13载体系列的优点所有的待测定的DNA片段,都能够共用一种引物。如此,就幸免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。最初使用的引物,是克隆在PBR322质粒载体上的一种短的限制片段。以后J、Mess