葡糖酸激酶IDNK在非小细胞肺癌中的功能及机制研究.pdfVIP

摘要 摘 要 葡糖酸激酶 (IDNK) 催化葡糖酸磷酸化生成 6-磷酸葡糖酸从而进入磷酸戊 糖途径，目前关于 IDNK 蛋白稳态调控及其在肿瘤发展中的功能研究甚少。在 本项目中，我们通过蛋白质免疫印迹实验发现 IDNK 在非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞中的蛋白表达高于人支气管上皮细胞，临床组织样本检测也发现 IDNK 在 非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁组织，这提示IDNK 可能在NSCLC 的发展 中发挥促进作用。我们通过细胞生长和克隆集落形成实验发现敲低 IDNK 可以 抑制非小细胞肺癌细胞的增殖；通过细胞划痕和 Transwell 迁移实验发现敲低 IDNK 抑制非小细胞肺癌细胞的迁移；质谱和蛋白质免疫共沉淀实验发现去泛 素化酶UCHL1 是IDNK 的相互作用蛋白，UCHL1 能够导致IDNK 的去泛素化 从而稳定IDNK 蛋白水平。 综上所述，我们的研究发现IDNK 在NSCLC 中高表达，明确了IDNK 在非 小细胞肺癌细胞增殖和迁移的作用，阐明了去泛素化酶UCHL1 调控IDNK 蛋白 稳态的分子机制，为NSCLC 的治疗提供新思路和新靶点。 关键词：葡糖酸激酶；UCHL1 ；去泛素化；非小细胞肺癌 II 目录 目 录 第1 章 引言1 1.1 非小细胞肺癌研究现状1 1.2 葡糖酸激酶IDNK 的研究现状2 1.3 去泛素化酶UCHL1 的研究现状3 第2 章 IDNK 促进非小细胞肺癌的增殖与迁移4 2.1 前言4 2.2 实验材料4 2.2.1 细胞系及组织样4 2.2.2 实验试剂5 2.2.3 实验耗材6 2.2.4 实验仪器7 2.3 实验方法8 2.3.1 细胞培养8 2.3.2 蛋白质电泳及免疫印迹技术9 2.3.3 稳定细胞系的构建10 2.3.4 细胞生长实验11 2.3.5 克隆集落实验12 2.3.6 细胞划痕实验12 2.3.7 Transwell 细胞迁移实验12 2.3.8 分子克隆及质粒构建13 2.3.9 统计分析16 2.4 结果16 2.4.1 IDNK 在非小细胞肺癌中呈高表达16 2.4.2 IDNK 促进非小细胞肺癌细胞的增殖17 2.4.3 敲低IDNK 抑制非小细胞肺癌细胞的迁移19 V 目录 2.5 讨论20 第3 章 UCHL1 稳定IDNK 的蛋白表达21 3.1 引言21 3.2 实验材料21 3.2.1 实验试剂21 3.2.2 实验耗材22 3.2.3 实验仪器22 3.3 实验方法22 3.3.1 细胞培养22 3.3.2 蛋白质电泳与印迹技术22 3.3.3 过表达质粒瞬时转染22 3.3.4 蛋白质免疫共沉淀23