酶工程课件-固定化酶和固定化细胞.pptVIP

固定化酶（细胞）对酶抑制剂（尿素）的稳定性变化 ⑵反应最适温度的变化 有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有明显的变化。 同一种酶，固定化方法不同，其最适温度也可能不同。 固定化酶的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响。 ⑶反应最适pH的变化 ①载体性质 ②产物性质 微环境 最适pH 载体（-） 吸引H＋，pH↓ 偏高 载体（＋） 吸引OH-，pH↑ 偏低 微环境 最适pH 产物（酸性） pH↓ 偏高 产物（碱性） pH↑ 偏低 微环境 固定化酶（细胞）对pH稳定性变化 底物专一性的变化与底物分子量大小有一定关系： 对于那些作用于低分子的酶？ 对于那些可作用于大分子底物又可作用于小分子 底物的酶，固定化前后？ 原因？ ⑷底物专一性变化 Km值？ 固定化酶的最大反应速度？ ⑸动力学参数变化 6.2.4固定化酶(细胞)的评估指标 固定化酶的活力测定 固定化酶的比活力测定p84 酶结合效率与酶活力回收率的测定 相对酶活力测定p85 固定化酶的半衰期 固定化酶(细胞)的活力p84 固定化酶(细胞)的单位可定义为每毫克干重固定化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量，表示为umol·min-1·mg-1。如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的反应初速度来表示，即umol·min-1·cm-2。 固定化酶通常呈颗粒状，其活力可在两种基本系统——填充床或均匀悬浮在保温介质中进行测定。 ①振荡测定法 ②酶柱测定法 ③连续测定法 酶结合效率=(加入的总酶活力-上清液的酶活力)/加入的总酶活力×100％ 活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100％ 结合效率=1时，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显； 结合效率1时，扩散限制对酶活力有影响； 结合效率1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。 酶结合效率及酶活力回收率的测定 固定化酶(细胞)的半衰期 固定化酶(细胞)的半衰期是指在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间。 6.3.固定化细胞 6.3.1固定化细胞的特点 6.3.2细胞固定化方法 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 固定化细胞与固定化酶比较，其优越性在于： ①固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，稳定性好。 ②固定化细胞保持了胞内原有的多酶系统，这对于多步催化转换，其优势更加明显，而且无需辅酶再生。 ③固定化细胞的密度提高，可提高生产能力； 6.3.1固定化细胞的特点 ④发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用； ⑤发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化； ⑥可提高基因工程菌的稳定性。 吸附螯合法 优点是可再生，条件温和、方法简便。 操作稳定性差 化学法(共价交联) 操作稳定性高 包埋法 只适于小分子底物 无载体固定化 6.3.2细胞固定化方法 (1) 去自溶酶法 (2) 絮凝法 固定化植物细胞 特点？ 固定化方法 吸咐法 包埋法 ①多糖的芳族氨基衍生物重氮化法 用试剂对-β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)研制了固定化糖酶和5′－磷酸二酯酶(RNase P1)等。 ②聚丙烯酰胺衍生物重氮化法 商品名为Bio-gel或Enzacryl。如Enzacryl AA ③多孔玻璃的氨基硅烷衍生物重氮化法 ⑵与戊二醛的反应偶联法 戊二醛与含伯胺基的聚合物反应，可以生成具有醛基功能的衍生物，然后与酶反应偶联： ⑶溴化氰-亚胺碳酸基法 乙基氯甲酸酯法 3-氨基丙基三乙基氧硅烷法 ⑷芳香烃基化法或者烷基化法 ⑸肽键结合法 这是酶分子与载体间用于形成肽键而被固定化的方法。又可分为以下几种活化方法：叠氮法、酸酐法、酰氯法、异硫氰酸法。 叠氮法 载体：羧甲基纤维素的迭氮衍生物 功能团：酶的氨基、羟基、巯基 如商品名为Enzacryl AH、Polymethylglutamate 酸酐法 功能团：酶的氨基，如Lys 载体：马来酐与乙烯或苯乙烯的共聚物 异硫氰酸法 功能团：酶的氨基 载体：氨基衍生物（多用苯乙烯氨基衍生物） ⑹金属偶联法 某些过渡金属，能使纤维素、尼龙硼硅玻璃、滤纸以及酵母细胞等，转化为固定化酶的载体。方法简单。常用的金属盐有钛、锡、锌、钒及铁的氯化物。 4交联法(crosslinking) 利用双功能试剂或多功能试剂，使酶分子之间或酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联，凝集成网状结构，而成固定化酶，此即交联法。 双功能试剂：戊二醛，已二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮氮苯，常用的是戊二醛 O O H — C — CH2 —