肿瘤细胞通过miR-30d调控GLI2-TGFβ1信号轴促进成纤维细胞转化的分子机制.pdf

摘要 摘要 研究目的： 肺癌作为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其 5 年生存率不足 20% 。肿瘤 相关成纤维细胞（CAFs ）是肿瘤微环境中的重要组成部分，大部分 CAFs 由肿 瘤细胞诱导成纤维细胞转化而来，在癌症的发生发展中起着关键促进作用。针 对肿瘤细胞对微环境的重塑机制制定靶向治疗策略，将有效提升患者的生存时 间。本研究从生物信息学、分子生物学和细胞生物学层面探讨肿瘤细胞miRNA 的异常表达对于促成纤维细胞重塑的作用及分子机制。 研究方法： 1. 采用生物信息学研究方法筛选与CAFs 相关的关键miRNA ，并用实时定 量荧光 PCR （qPCR ）验证miR-30d-5p 在肿瘤细胞及支气管上皮细胞中的表达 情况； 2. 运用qPCR、蛋白印迹（WB ）和免疫荧光（IF ）技术验证miR-30d-5p 的 异常表达与肿瘤细胞诱导正常相关成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞（CAFs ） 转化的关系； 3. 使用生物信息学、RNA-seq、qPCR、WB 探索 miR-30d-5p 对肿瘤细胞 中TGFβ 通路的调控； 4. 利用RNA-seq、Double luciferase reporter gene assay 、qPCR、WB 、IF 研 究miR-30d-5p 通过非经典激活Hedgehog-GLI2 通路的分子机制； 5. 结合位点预测和Double luciferase reporter gene assay 探讨转录因子GLI2 与TGFβ1 的调控关系。研究GLI2 调控TGFβ1 在肺腺癌细胞中的表达，从而影 响成纤维细胞的转化。 研究结果： 1. miR-30d-5p 在 CAFs 富集肿瘤中低表达，正常细胞中高表达，并与预后 相关； 2. 抑制正常肺上皮细胞中的 miR-30d-5p 导致肿瘤细胞诱导 NAFs 转化为 CAFs ，而LUAD 细胞系中过表达的miR-30d-5p 可以抑制NAFs 转化为CAFs ； 3. miR-30d-5p 缺失促进了 TGFβ1 的上调，此外，miR-30d-5p 通过 TGFβ1 促进了CAFs 的转化； II 摘要 4. miR-30d-5p 通过非经典途径直接抑制 GLI2 并调控TGFβ1 表达，同时， miR-30d-5p 通过GLI2 影响成纤维细胞的转化； 5. TGFβ1 是转录因子GLI2 的下游靶基因，介导GLI2 促成纤维细胞的转化 效应。 研究结论： 肺腺癌细胞中低表达的miR-30d-5p 可以非经典激活GLI2 调控TGFβ1 促进 肿瘤微环境中成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化。 关键词：肺腺癌；肿瘤微环境；成纤维细胞；miR-30d-5p；GLI2 ；TGFβ1 III 目录 目录 第一章前言1 1.1 肿瘤微环境和肿瘤相关成纤维细胞1 1.2 miRNA 和肿瘤2 1.3 Hedgehog 信号通路3 1.4 TGFB1 3 第二章材料与方法5 2.1 实验材料、试剂与器材5 2.1.1 细胞系5 2.1.2 载体、质粒5 2.1.3 主要试剂与实验器材7 2.2 实验试剂配制10 2.2.1 完全培养基配制：10 2.2.2 Western blot 主要溶液配制：10 2.2.3 大肠杆菌培养相关试剂： 11 2.2.4 质粒小提试剂准备： 11 2.3 实验方法 11