分子生物学基因组概述.pptVIP

图6 具有poly(A)的mRNA在oligo(dT)引物和反转录酶的作用下，可合成出双链cDNA。随后将它与质粒载体构成重组分子，并转化给大肠杆菌寄主细胞进行扩增。应用这种方法能够分离和扩增我们所期望研究的基因或DNA片段 末端转移酶（Terminaltransferase,TdT）是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3羟基端。 TdT S1核酸酶 第六十三页，共八十四页，2022年，8月28日 （l）cDNA文库的构建　（i）构建cDNA文库的第一步是分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的分部。一段仅由脱氧胸腺嘧啶核苷酸组成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]，能够同惰性物质如纤维素（或琼脂糖）结合。当细胞总 RNA制剂通过已用oligo（dT）处理过的纤维素柱时，mRNA分子的pol（A）尾巴便会同oligo（dT）序列杂交而粘附到柱子的填充物纤维素上，而其余的rRNA及tRNA分子则流出柱子。经过处理，可从纤维素柱子中洗脱下了纯净的mRNA分子（图7） 。　（ii）构建 cDNA文库第二步是合成第一链 cDNA。其中一种方法叫做oligo（dT）引导的cDNA合成法。　　另外一种叫做随机引物引导的cDNA合成法（randomly primed cDNA synthesis ）。此法的基本原理是，根据许多可能的序列，合成出6～10个核苷酸长的寡核昔酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在这种情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生。 第六十四页，共八十四页，2022年，8月28日 poly(A)mRNA与oligo(dT)杂交而被吸附，其它的RNA及rRNA仍处游离状态 加入总RNA(mRNA, tRNA和rRNA) 收集洗脱下来的poly(A)mRNA 图7 用纤维素柱纯化poly(A)mRNA的流程示意图 oligo(dT)纤维素 100mM NaCI 洗脱下来的 tRNA和rRNA 100mM Tris 1mM EDTA 第六十五页，共八十四页，2022年，8月28日 （iii）构建cDNA文库第三步是将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。可采用自我引导合成法或置换合成。 （iv）构建cDNA文库的第四步是将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞增殖。 　　重组的方式是先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或者更常用的是将人工合成的衔接物加到双链cDNA分子的两端，尔后再同经适当处理而具有相应末端的载体分子连接。将如此构成的重组体分子导入大肠杆菌寄主细胞进行扩增，于是便得到了所需的 cDNA文库。 图8表示出了λ噬菌体载体λgt为双链DNA克隆的基本流程。 第六十六页，共八十四页，2022年，8月28日 图8 以λ噬菌体作载体构建成cDNA文库的流程图 第六十七页，共八十四页，2022年，8月28日 λ噬菌体与细菌质粒相比较，它可以携带较长的外源DNA片段，其最大容量为18－22kb，这是因为在λ噬菌体基因组中含有一个从基因J之后到N之前的非必需区，也称为可替代区，它约占整个λ基因组的1／3。如果用外源基因片段替代这个区域，不会影响噬菌体颗粒的形成，正是这一特性构成了λ噬菌体作为外源基因克隆载体的基础。 　 λ噬菌体的感染能力与包装在衣壳内的DNA长度有关，通常野生型λDNA长度为48.5kb，具有很强的感染力，而当DNA长度为野生型λDNA长度的75％或 105％时，λ噬菌体虽然能够包装成具有感染性的颗粒，但感染效率明显降低。若DNA长度短于野生型λDNA长度的75％或超出105％，则不能形成具有感染性的噬菌体颗粒，因此在利用λ载体构建基因克隆重组体时，应当注意选择合适大小的外源DNA片段。 第六十八页，共八十四页，2022年，8月28日 　 λgt11和λgt10均可用于cDNA文库的构建，但当以核酸探针筛选重组体时，一般选用λgt10。λgt10在基因 CⅠ内有一个 EcoRⅠ酶切位点，外源基因片段从 EcoRⅠ位点的插入可使基因 CⅠ失活，重组体呈现为 CⅠ表型产生清亮型噬斑，其重组体的繁殖需选用高频率溶原性突变株。即大肠杆菌的hfl突变株，λgt10在此宿主菌中不能形成噬斑，而重组体能以正常的效率感染宿主菌，并且有效地产生噬斑，利用这一特性可对重组体进行筛选。 λ噬菌体 第六十九页，共八十四页，2022年，8月28日 λgt11是一种表达型的载体，这种λ载体不仅可以扩增外源DNA片段，而且还可在大肠杆菌中表达外源DNA片段。该载体带有大肠杆菌的LacZ基因片段，在半乳糖苷酶基因终止密码子上游的 53bp处存在单一的 EcoRⅠ酶切位点，它可供外源基因片段的插