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基因工程第二章基因工程工具酶;工具酶 -----DNA分子的切割和连接技术。 Smith发现了第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE) 对DNA分子有特异地切割作用。（手术刀剪） Khorana又发现了T4DNA连接酶（Ligase），能将DNA片段连接在一起。（缝纫机、浆糊） DNA、RNA聚合酶和反转录酶等合成酶。（复印机） 构成了一个研究DNA、 RNA分子的工具酶箱。;第一节 限制性核酸内切酶;寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的，一种叫修饰的甲基转移酶，另一种叫核酸内切限制酶。;第五页，共八十二页，2022年，8月28日;第六页，共八十二页，2022年，8月28日;寄主控制的限制与修饰的作用， 一是保护自身的DNA不受限制； 二是破坏外源DNA使之迅速降解。 根据限制-修饰现象发现的核酸内切限制酶，现在已成为重组DNA技术学的重要工具酶。纯化后的限制性内切酶允许分子生物学家以一种精确的可重复的方式切割基因克隆所需的DNA分子。 这些酶的发现是基因工程发展过程中的一项突破性进展。;二、限制性核酸内切酶的类型 根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 Ⅱ类：基因工程的工具酶。 Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点24 bp～ 26 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。 已有超过1200种。;性质;性质;性质;三、限制性核酸内切酶的命名 等于1973年提议的命名系统。 名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写； 第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写； 如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；若酶的编码基因位于噬菌体或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外的遗传成分； 最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。 前三个字母用斜体表示。 ;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;所有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠??系统名称 内切酶系统名称 R；甲基化酶系统名称 M。 例如 R. Hind Ⅲ，表示内切酶 M. Hind Ⅲ，表示甲基化酶 但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。 ;通常情况下，需要对克隆的DNA进行切割。 首先，如果以克隆单个基因为目的，该单个基因可能仅仅包含2-3kb DNA，则这个基因不得不从大的(通常情况下超过80kb)DNA分子中切割出来。 其次，大的DNA分子不得不被切断成小的足以被载体携带的片段。 绝大多数克隆载体能够承载的DNA片段处于一个特定的大小范围中。 比如，以M13噬菌体为基础的载体，所克隆的DNA分子超过3kb时运载效率非常低。;第十六页，共八十二页，2022年，8月28日;第十七页，共八十二页，2022年，8月28日;四、 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4--8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome) 。 ;Bam HⅠ;5’ 粘端切口;CTCGAG GAGCTC;第二十二页，共八十二页，2022年，8月28日;DNA分子中识别序列的出现频率;;第二十五页，共八十二页，2022年，8月28日;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;五、限制性内切酶的酶切反应条件;2. 限制性内切酶的用量 供应商提供纯的已知浓度的溶液。 1个酶单位： 被定义为在合适的温度与缓冲液中，在20μL反应体系中，1h完全切割1μg DNA所需要的酶量。 对于大量DNA的酶解，反应体积可按比例扩大，加入过量的酶（2～5倍）和较长的反应时间。;3. 反应温度： 绝大多数，37℃时活性达到最大； 一小部分需要不同的工作温度，如SamⅠ酶消化时，25℃才能达到酶的最大活性。BacⅠ酶消化时，50℃才能达到酶的最大活性。 ;4. 酶解过程： 酶解体系的确定； 成分的混匀； 酶切反应；