细胞固定化实验.docxVIP

一、实验目的 通过学生自主设计固定化工艺（如微生物细胞种类、固定材料和固定化方法），达到了解微生物细胞固定化原理，学习、掌握微生物细胞的固定化方法，锻炼学生动手动脑能力，提高科研素质的实验目的。 二、实验原理 微生物细胞固定化的原理是将微生物活细胞利用物理或化学的方法，使细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持微生物的活性。细胞固定化的优点是：固定化细胞能反复使用，发酵完毕，菌体与发酵液易于分离，后处理工艺简单，成本降低。固定后的微生物细胞可实现高密度填充，因而可进行高密度连续的微生物发酵，极大提高生产效率。该项技术是近代为微生物工程上的重要革新，展示着广阔的前景。 微生物细胞的固定化常用的载体有：①多糖类（纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、海藻酸钙、k-卡拉胶）；② 蛋白质（骨胶原、明胶）；③ 无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等）；④ 合成载体（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等）。选择载体的原则以无毒、廉价、高强度为好。 微生物细胞固定的方法常用的有吸附法、包埋法和共价交联法三类。 （1）吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上， 分物理吸附法与离子结合法。物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体将微生物细胞吸附住。离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当的条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。吸附法优点是操作简便、载体可再生；缺点是细胞与载体的结合力弱，pH、离子强度等外界条件变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。 （2）包埋法是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不止漏出，而底物和产物可以进入和渗出。细胞和载体不起任何结合反应，细胞处于最佳生理状态。因此，酶的稳定性高，活力持久，所以，目前对于微生物细胞的固定化大多采用包埋法。 （3）共价交联法是利用多功能或双功能交联剂，使载体和微生物细胞相互交联起来成为固定化活细胞。 常用的最有效的交联剂是戊二醛，这是一种双功能的交联剂，其分子中的一个功能团与载体交联，另一个功能团与细胞交联。此法最为突出的优点是固定化细胞稳定稳定性好，共价交联剂和载体都丰富。 到目前为止，尚无一种可用于所有种类的微生物细胞的固定化的方法。因此，对某种特定的微生物细胞来说，必须选择其合适的固定化方法和条件。 三、实验材料 1. 菌种 本实验所固定的微生物为酿酒酵母。 2. 材料 本实验要求采用包埋法进行细胞固定化。包埋材料：海藻酸钠。 实验步骤（海藻酸钙固定法） 工艺流程 培养基制备→10%接种→28℃～30℃震荡培养→离心收集细胞→悬浮于10～15mL无菌去离子水中→加入4%海藻酸钠溶液→充分混匀→滴入6.6% CaCl2 溶液固定化→室温下静置2h→无菌水洗涤1～2次→加入已灭菌的培养基→28℃～30℃静态发酵→更换培养基→二次发酵→酒精含量测定。 注意事项 （1）每组需用的实验仪器 250mL三角瓶6支：3支用于制备培养基、1支用于制备无菌水、1支配制海藻酸钠溶液、1支配制CaCl2。 10mL注射器1支、酒精灯1个、200mL量筒1支、 玻璃棒1支（灭菌）、烧杯1个。 （2）共享仪器、设备： 培养箱、无菌室、超净工作台 （3）培养基及溶液配制 600mL培养基：分装于3支250mL三角瓶中，其中1支装液量150mL，用于菌体制备，另外2支用于酒精发酵；121℃下灭菌15～20min。 去离子水：200mL装于250mL三角瓶，灭菌。 4％海藻酸钠：100mL装于250mL三角瓶，灭菌 6.6％CaCl2：200ml装于500ml三角瓶，灭菌 （4）其它事项： 培养基组成：葡萄糖16%，酵母粉1.5%，蛋白胨1.5%，硫酸铵0.2% ，磷酸二氢钾0.2%，pH 6～7。 糖度不宜过低；写好标签；配制培养基可用自来水；玻璃棒要包裹后，灭菌 酒精含量测定： 采用液相法。 五、实验结果 第一次酒精发酵：酒精度 5.1% 第二次酒精发酵：酒精度 6.8% 六、结果分析 最终的酒精度较低，其原因是：尽管采用了较高细胞密度的发酵，但所培养的细胞浓度不够高（菌体培养时间不足24h），发酵时间也较短，从而造成发酵液中酒精含量稍低。 第二次发酵的酒精度比第一次发酵的，其原因是二次发酵比一次发酵长了约12小时。 同样的葡萄糖浓度，但发酵的酒精度不一样，其原因之一是培养基的其他成分含量不同。 思考题 1.制备固定化活细胞的操作中，应重点掌握那几个技术环节？ 制备固定化酵母细胞的实验中，首先需要用蒸馏水活化酵母细胞。此时酵母细胞体积增大，应选择较大的容器，防止溢出。在配制海藻酸钠溶液时，要用小火间断加热，防止海藻酸钠溶液焦糊。混合之前,海藻酸钠溶液要冷却至室温,然后加人已活化的酵母细胞并进行充分搅拌,混合均匀后，再转移