免疫组化技术.pptVIP

免疫组化技术;四大常用基本技术;免疫组织化学技术;免疫组化技术的分类;基本原理; 免疫组化的全过程;常用标本的获得;免疫组化对组织和细胞标本的要求 ： 保持所检标本原有的结构、形态； 在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。 ; 标本的获得;标本的固定与保存;常用固定剂;常用固定剂;常用固定剂;常用固定剂;戊二醛： 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。;常用固定剂;常用固定剂; 冰冻切片和石蜡切片是免疫组化中最常用的制片方法。 冰冻切片 制片方法简单 较好的保存组织的抗原免疫活性，避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。 细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散 切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮 ;石蜡切片：观察组织细胞结构的理想方法 较好的保持组织细胞的形态结构 切片有连续性 长期存档，供回顾性研究 由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。 抗原的保存量不如冰冻切片。;抗原修复;抗原修复;抗原修复;抗原修复;抗原修复;抗原修复; ;抗体的分类;抗体的选择（一抗）;一抗的获得;抗体的标记（二抗）;常用的染色方法;常用的染色方法; 荧光素 作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物;荧光显微镜;免疫荧光染色;免疫荧光双标染色;荧光显微镜与激光共聚焦显微镜;常用的染色方法;常用的标记酶及其显色底物 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)： DAB或AEC显色系统 （结果染为棕黄色） 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)： NBT/BCIP（结果染为蓝黑色） ;DAB显色;ABC法（avidin-biotin complex亲和素-生物素法）： 组成： 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素）;;免疫胶体金技术：以特殊的金属颗粒胶体金作为标记物。 基本原理：胶体金是金的水溶胶，??能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。 优点：由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。;背景染色;Cub ilin分布于近端小管的刷状缘和近官腔面, 而在远端小管和细段及集合管上无分布。 远端小管有背景, 淡棕黄色( 图1、2)。 组织上无背景, 远端小管胞质为淡蓝色（图3、4）;Ig与Fc受体结合 ：多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。 二抗与组织中的Ig结合：如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越明显，如人与猴，兔与豚鼠。 ;静电吸附 抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。 组织中残存醛基与Ig的结合 内源性过氧化物酶 ;缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。 非特异性组分与抗体结合，延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。必要时也可采用2-5%的BSA封闭，减少非特异性染色。 适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要 ;内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色； 缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等； 防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。 ;设立对照组;空白对照/阴性对照：第一抗体由PBS取代。 替代对照：与第一抗体同种动物的非免疫性的正常血清代替第一抗体结果为 阴性。如第一抗体用的是兔抗人GFAP的IgG抗体，对照中用非 免疫性的正常IgG血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照 。 阳性对照：用已知含有要检测抗原的切片作阳性对照。 自身对照：在同一切片上，将不同组织成分中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如果应为阳性的组织是阳性，则免疫组化技术正确，如为