DNA芯片原理、分类与操作.pptVIP

DNA芯片 DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探针，或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。 由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片又被称为基因芯片（gene chips）、DNA阵列（DNA array）、cDNA芯片（cDNA chips）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）等。 第一页，共二十八页。 DNA芯片技术 DNA芯片原理及分类 DNA芯片的操作 DNA芯片技术的应用与展望 第二页，共二十八页。 DNA芯片的基本原理 基因芯片的原理是基于核酸分子碱基之间(A-T/C-G互补配对的原理,利用分子生物学、基因组学、信息技术、微电子、精密机械和光电子等技术将基因或DNA分子排列在特定固体物表面构成的微点阵。然后将标记的样品分子与微点阵上的DNA杂交,以实现多达数万个分子之间的杂交反应,高通量大规模地分析检测样品中多个基因地表达状况或者特定基因(DNA)分子的是否存在的目的 基因芯片的优点： 高通量·大规模·高度平行性·快速高效·高灵敏度·高度自动化 缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。 DNA芯片 第三页，共二十八页。 制备原理 原理 -- 通过杂交检测信息 一组寡核苷酸探针 — TATGCAATCTAG CGTTAGAT ACGTTAGA ATACGTTAGATC TACGTTAG 由杂交位置确定的一组 核酸探针序列 GTTAGATC 杂交探针组 TATGCAATCTAG 重组的互补序列 靶序列 TACGTTAG ACGTTAGA ATACGTTA CGTTAGAT GTTAGATC ATACGTTA DNA芯片 第四页，共二十八页。 DNA芯片分类 根据DNA芯片的制备方式可以将其分为两大类： 原位合成芯片 synthetic genechips:指采用显微光蚀刻技术在芯片的特定部位合成寡核苷酸而制成的芯片。 特点：合成的寡核苷酸链较短，密度较高。 DNA 微集阵列 DNA microarry:指将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面。 特点：片段较长，密度较低。 DNA芯片 第五页，共二十八页。 DNA芯片的操作及应用 DNA芯片 第六页，共二十八页。 基因芯片使用步骤 芯片制作 把探针固定于载体表面 样品处理 目标分子富集 分子间的杂交 结果检测与数据分析 DNA芯片 第七页，共二十八页。 基因芯片 荧光标记的样品 共聚焦显微镜 获取荧光图象 杂交结果分析 探 针 设 计 杂交 DNA芯片 第八页，共二十八页。 DNA芯片的制备 芯片的制备包括 支持物的预处理、 原位合成芯片的准备 DNA微集陈列的制备 DNA芯片 基因芯片结构示意图 第九页，共二十八页。 DNA芯片的制备 支持物分两类 实性材料 包括硅芯片，玻璃，瓷片等。目前最常用者为玻璃。预处理的目的是使其表面形成羟基，氨基等活性基团，以便与单核苷酸或DNA形成共价键 膜性材料 包括聚丙烯膜，尼龙膜，硝酸纤维素膜等 通常要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷，以吸附DNA 支持物的预处理: DNA芯片 第十页，共二十八页。 DNA芯片的制备 原位合成芯片的制备 1 显微光蚀刻技术 优点：合成速度快，步骤少 缺点：合成的探针短，效率低 2 压电打印法 合成的探针可达40-50 nt，合成效率较高 DNA芯片 第十一页，共二十八页。 DNA微阵列的制备 采用事先合成的DNA或制备基因探针，然后打印在支持物上 喷墨打印 优点：速度快，量准，对支持物表面要求低； 缺点：斑点大，探针密度低，液滴分配不均 针式打印 优点：简便，价低，液滴小，探针密度大； 缺点：准确性和重现性差 DNA芯片的制备 DNA芯片 第十二页，共二十八页。 喷墨打印技术 DNA芯片 第十三页，共二十八页。 针式打印法（接触式点样） Best! DNA芯片 第十四页，共二十八页。 点阵的制作 DNA芯片 第十五页，共二十八页。 样品的准备 样品的准备包括 样品的分离纯化 扩增 标记 DNA芯片 第十六页，共二十八页。 分离纯化：样品来源于活的细胞，使用一定方法分离并纯化DNA或RNA（特别是mRNA）。只有达到一定纯度的样品，才能保证后续操作的正确。 目前分离纯化使用的试剂均有商品出售，品牌繁多，原理也不尽相同，产物收率和耗时也相差甚远 分离