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试验完成后进行数据分析 * * 第三十页，共五十七页。 试验完成后进行数据分析 * * 第三十一页，共五十七页。 试验完成后进行数据分析 E0.3125 E0.25 E2 * * 第三十二页，共五十七页。 3 ）干扰初筛试验 目的及原理 只有在无干扰情况下，样品的内毒素检测结果才是有效的。 通过检测从供试品原液到其MVD或MVC之间的稀释液，计算内毒素回收率，判断供试品浓度对BET的干扰情况。 * * 第三十三页，共五十七页。 试验步骤 1、供试品限值的确定 2、试剂的选择 3、供试品最大有效稀释的计算 4、反应溶液的制备 5、加样及反应 6、结果判断 * * 第三十四页，共五十七页。 干扰初筛试验举例 供试品限值 硫酸庆大霉素，100ml/瓶，5000U/ml； 药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U * * 第三十五页，共五十七页。 试剂 本试验使用鲎试剂的检测范围为10~0.03EU/ml，选择标准曲线浓度为2、0.25、0.03EU/ml 试剂名称 厂家 装量 规格 动态浊度法TAL 安度斯 1.25ml/支 10~0.03EU/ml 内毒素标准品（CSE） 安度斯 10ng/支 10EU/ng（CoA） BET水（W） 安度斯 25ml/瓶 内毒素0.003EU/ml * * 第三十六页，共五十七页。 最大有效稀释倍数的计算 光度测定法中，供试品最大有效稀释倍数计算公式： MVD=cL/λ，其中λ为标准曲线最低点浓度 本试验， MVD= 5000U/ml x 0.5EU/1000U 0.03EU/ml =80（倍） * * 第三十七页，共五十七页。 各反应溶液的制备 溶液C的制备 E100 0.4ml 3.6ml W E10 0.8ml 3.2ml W E2 0.4ml 2.8ml W E0.25 S原液 0.4ml 3.6ml W S10 1.4ml 1.4ml W S20 1.4ml 1.4ml W S40 1.4ml 1.4ml W S80 备用液 0.4ml 2.8ml W E0.03 溶液A的制备 E0.5 0.8ml 2.4ml W 备用液 * * 第三十八页，共五十七页。 溶液B的制备 E0.5 S10 0.5ml 0.5ml S20 E0.25 E0.5 S40 0.5ml 0.5ml S80 E0.25 E0.5 S20 0.5ml 0.5ml S40 E0.25 * * 第三十九页，共五十七页。 加样及反应 取TAL两支，参照标准曲线可靠性试验中的方法将其复溶； 复溶鲎试剂后，运行软件，使其进入待采集状态； 将两支复溶好的鲎试剂溶液合并在一起，轻轻混匀避免产生气泡； 将鲎试剂液分装至20支反应试管中，0.1ml/管； 将相应的溶液A、B、C、D加至反应管中，0.1mL/管，每浓度平行2管 E0.03 E0.25 E2 溶液C 溶液D W S20 S40 S80 S20E0. 25 S40E0. 25 S80E0. 25 溶液A 溶液A 溶液A 溶液B 溶液B 溶液B * * 第四十页，共五十七页。 结果判断 药典要求 1、阴性对照的反应时间（TD ）大于标准曲线最低浓度的反应时间（Tλ） 2、标准曲线的相关系数|r|≥0.980 3、回收率R满足：50% ≤R ≤200% 厂家建议值 4、变异系数CV%10% * * 第四十一页，共五十七页。 光度测定法BET检查技术 湛江安度斯生物有限公司 2009年3月 第一页，共五十七页。 1、光度测定法方法学分类 2、光度测定法原理 3、动态比浊法BET 4、终点比色法BET * * 第二页，共五十七页。 1、光度测定法方法学分类 光度测定法（定量法检测） 浊度法 显色法 动态浊度法 终点浊度法 动态显色法 终点显色法 (比浊法) (比色法) * * 第三页，共五十七页。 2、光度测定法原理 光电转换原理 光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。 当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流I，我们称I为透光强度。 入射光 反应混合物 透射光 光电池 I 透光容器 * * 第四页，共五十七页。 设：初始时的透光强度为Is，某时刻的透光强度为It定义1：透光度（Rt）：  Rt=It/Is(%) 初始时It=Is，Rt=100%，Rt曲线变化趋势是由高至低。 定义2： 吸光度(OD)： OD= -lg(It/Is) 初始时It=Is，OD=0，OD曲线变化趋势是由低至升高。