分子生物学诊断技术进展.pptxVIP

分子生物学诊断技术进展第1页/共61页 2主要内容：分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用简单介绍实验原理以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例分子诊断技术在以下病原研究的应用进展乙型肝炎丙型肝炎结核分枝杆菌第2页/共61页 3病原学检测常用的实验室技术细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验血清学、免疫学诊断技术电镜技术分子生物学诊断技术第3页/共61页 4分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术具体方法举例 循环扩增PCR （聚合酶链反应） Real-time PCR, RT-PCR，巢式PCR，复合PCR PCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法LCR（连接酶链反应） 恒温NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA）SDA（链置换扩增术） CPT（环状探针技术 ）bDNA（枝链核酸信号放大系统 ）杂交捕获 （如：检测HPV-DNA的试剂盒）第4页/共61页 5分子诊断技术方法简介2、多标靶同时检测多重PCR毛细管电泳以测序分析为基础的检测技术第5页/共61页 6分子诊断技术方法简介3、核酸杂交DNA荧光原位杂交（FISH）将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。 线性探针分析法（LiPA）杂交保护分析法（HPA）4、质谱利用色、质谱结合PCR技术第6页/共61页 7分子诊断的功能及扩展病原的诊断和鉴别诊断病原分型病毒载量监测---个体化治疗的依据疗效及预后标志其他：病原感染中发生、发展各阶段第7页/共61页 8分子诊断的功能及扩展疾病分型及意义例如：HPV （30/100） 高危---16，18，31，45 低危--- 6，11第8页/共61页 9分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗 例1.---北京地坛医院谢尧提供第9页/共61页 10分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例2. HBV---干扰素 HBV100pg/mL 11/30 阴转 HBV100pg/mL 1/30 阴转 (HBeAg ?HBeAb)第10页/共61页 11分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例3. HIV病毒载量与传播 15127人 流行病学调查415对伴侣 30个月 HIV阳转22%（90/415） 51人RNA1500copies/mL 全阴第11页/共61页 12分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例4. 血浆EBV载量与鼻咽癌复发 15个二年持续缓解： 0 copy/mL 10个复发： 32250 copies/mL 17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高第12页/共61页 13耐药病原的分子诊断WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用HBV的YMDD变异HIV耐药第13页/共61页 14血制品筛查300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：HBV：47HCV：10HIV-1：2 -2001年剑桥资料 HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6% -Am. J. Chin Athol. 2000第14页/共61页 15在基础研究领域中的应用；遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 如血友病、地中海贫血等肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；骨髓移植、器官移植供体配型选择；法医学、动植物学、古人类学、古生物学； 与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；药物基因组学、耐药基因的检测，等等分子生物学技术在其它领域的应用第15页/共61页 16简单介绍实验原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应) 荧光实时定量PCR （real time PCR）NASBA （依赖核酸序列的扩增）第16页/共61页 17PCR原理:实质就是体外基因复制技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA聚合酶 AmpErasePrimer靶序列加热变性95 °C靶序列引物退火55 °C引物延伸72 °C第17页/共61页 18PCR 循环 第一步 – 加热变性靶序列靶序列 从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。第18页/共61页 19PCR 循环第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinB