哈尔滨工程大学《细胞生物学》课件-第8章蛋白研究的各种方法.pptVIP

Three 在许多蛋白特别是转录因子中都存在磷酸化和去磷酸化作用。转录因子的磷酸化、去磷酸化可能影响：1）转录因子从细胞质向细胞核转运或相反。2）转录因子与特异DNA序列的结合。3）调节转录因子的转录激活功能区与其他因子的作用。机理：1，磷酸化增加了反式作用因子的反式激活结构域与基础转录元件或转录起始复合物之间的亲和力。2，磷酸化改变了转录活化结构域的空间构象 。3，磷酸化促使反式激活结构域与阻遏蛋白解离，或促进其与DNA结合。4，增加蛋白质分子表面的负电荷。 蛋白质磷酸化的调控机理和特点 特点：1，迅速。2，激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆转。3，能够有效地整合来自不同转导途径的信号。4，同一种激酶或磷酸酶都是多底物的，对不同转录因子的影响不同。5，蛋白因子上被修饰的氨基酸残基不同，对转录因子功能的影响也不同。 磷酸化研究方法 特异性磷酸化抗体直接证明 CIAP或OA间接证明 片段缺失突变和点突变直接证明 同位素标记 质谱分析 CIAP或OA处理细胞证明蛋白磷酸化 CIAP：牛小肠碱性磷酸酶，能够将DNA以及蛋白上的磷酸根基团去除（孵育蛋白）； OA：冈田酸，磷酸酶抑制剂（细胞处理） 流式细胞术直接定量分析细胞存活率 PI（碘化丙啶）染色细胞，不能透过活细胞膜，但可以结合到死细胞的DNA碎片上。所以细胞表现出不同的荧光值。 流式细胞术定量蛋白表达量 限制：仅用于膜蛋白含量的检测。 关键点：抗体，相应的荧光素标记的二抗；流式细胞仪。 蛋白表达量以面积表示。 流式细胞术检测细胞中DNA合成量(BrdU法) JC－1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料，具有电势依赖性积聚于线粒体内膜的特性。 它在线粒体上以单体和聚合体两种不同的物理形式存在。 JC－1特异地与线粒体内膜结合，只在线粒体膜电位崩解的时候才释放出来，因此，检验结果可靠，敏感性高。 荧光探针JC-1检测线粒体膜电位 蛋白结构的分析 利用Edman降解法直接测定蛋白质分子中的肽段序列，并拼接出蛋白质分子的全序列。 根据蛋白质的cDNA序列的测定，推断出蛋白质分子的序列。 质谱分析：通过酶解产生肽段片段，通过质谱仪分析肽指纹图谱，从而获得氨基酸序列，再与网上蛋白库匹配，来确定是已知还是未知蛋白。 蛋白质一级结构测定方法 生物质谱检测制备技术 2D胶电泳－切胶－脱色 －脱水－还原－烷基化 －洗胶－脱水－泡涨－ 脱水－重泡涨－酶切－ 萃取－干燥－质谱分析 蛋白质空间结构测定方法 X射线衍射方法测定蛋白质分子的晶体结构。 二维核磁共振技术测定蛋白质分子在溶液中的结构。 用于测定蛋白质空间结构相对变化和变化速度的方法有：荧光滴定技术，紫外差吸收，园二色光谱，红外光谱，Raman光谱，脲梯度电泳，各种反应基团的暴露。 核磁共振仪分析蛋白质的二级结构 核磁共振图谱 * 计算方程： lg(Fo/F-1)=lgKA+nlg[Q]； 其中： Fo，F分别为蛋白质与药物作用前后的荧光强度； [Q]为药物浓度； KA为结合常数。 以lg(Fo/F-1)对lg[Q]作图，可求得药物与蛋白分子的结合常数和结合位点数。 荧光滴定方法分析小分子化合物与蛋白的结合 关键点： 荧光分光光度计 纯化蛋白（能够自发荧光，脯氨酸、色氨酸基团） 蛋白质相互作用仪 Cell, virus, bacteria, protein, DNA and small molecular; antibody-antigen, receptor-ligand, DNA-DNA, DNA-protein, protein-small molecular etc. 全自动，高通量，实时检测，快速分析生物分子之间的相互作用 ; 相互作用分析包括：分子结合定量分析, 动力学和亲和性分析，结合能力和协同性分析（结合速率Ka，解离速率Kd，结合常数KD） 不用对样品作任何标记和修饰 圆二色谱分析蛋白构象改变 旋光值计算： 分子对接模拟预测化合物与蛋白结合的模型 Kd=1.68 ?M Kd: ND 分析超离方法检测化合物与蛋白的相互作用 原子力显微镜(AFM) 优点：1)原子力显微镜作为扫描探针显微镜的一种，可观察生物形态结构。2）利用AFM,可使得细胞及生物大分子在生理溶液的条件下成像。 AFM对于生物系统的成像分析比光学显微镜具有更高的分辨率（大约可以到1nm），比电镜观察所需要的样品处理更接近于生理条件，并且比光谱学技术（通常需要从大量光谱信号中间接推导出结构信息）更直观。而相对于晶体学方法来说，AFM分析不需要依靠于晶体样品，这非常有利于研究天然状态下的生物样品。 蛋白修饰 泛素化 (ubiqu