三章节细胞生物学研究方法.pptxVIP

;第一节 细胞形态结构的观察方法;一、光学显微镜技术;分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。光学显微镜的 最小分辨率为0.2um，电子显微镜的最小分辨率为0.2nm。;（一） 普通复式光学显微镜技术;（二）荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）;;;（三） 激光共焦点扫描电镜技术 （laser scanning confocal microscopy）;;（四）相差和微分干涉显微镜技术;特点和应用：不需要染色，可观察活细胞、细胞 核、线粒体等细胞器的动态。在医学和生物学方 面应用广泛，如血液的观察，脓汁、分泌物的观 察，细胞癌变得早期诊断，细胞的运动、细胞分 裂现象的观察等。;2. 微分干涉显微镜 (differential－interference microscope）;;A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM. a) under bright-field b) phase-contrast c) DIM;倒置显微镜：由于物镜、聚光镜和光源的位置颠倒过来而得名。它的物镜和聚光镜之间的工作距离很长，能直接对培养皿中的培养细胞进行观察。还可与电视录像、相差物镜、电影摄影等装置相连。;二、电子显微镜技术（EM）;电子显微镜与光学显微镜光路图的比较;显微镜;基本构造：（1）电子束照明系统：电子枪和聚光镜 （2）成像系统：物镜、中间镜和投影镜 （3）真空系统 （4）记录系统：荧光屏和感光胶片;电镜制样技术;1. 超薄切片技术;固定;（1）戊二醛 1963年开始用作超薄切片的固定剂。 作用原理：醛基和蛋白质、磷脂中的氨基结合，把相邻的蛋白 质交联起来，形成不可溶的网络。对于蛋白质、多糖和核酸的 固定效果好，对脂类的差。 优点：分子量小，比较容易进入细胞，固定的标本可大些（小 于1－2mm）。;;;超薄切片技术的应用：除了单独应用于组织细胞的结构观察 外，还可与放射性同位素自显影、细胞化学、免疫电镜和电 镜原位杂交等技术结合，用于不同目的的研究。; 又称阴性反差染色，由Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用。负染法是将颗粒或者纤维样品分散在具有亲水性支持 膜的载网上，然后滴加磷钨酸或醋酸双氧铀等染料，并随即吸 去多于地染液，样品干燥后残余染料将沉积在样品的周围以及 样品的凹陷、缝隙处，而样品本身呈浅色，所以称为负染。;Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).; 又称为冷冻蚀刻、冷冻断裂，是一种由冷冻断裂和复型 相结合的样品制备技术。由Hall于1950年提出，1957年开始 应用于生物样品的制备。 操作步骤：迅速冷冻使样品固定、硬化 ，在真空中切断，使 冰升华，暴露出断裂面的结构，再在切面上喷镀一层铂，碳 投影，形成复型膜，在电镜下观察。 优点： (1)能较好的保存生物大分子的天然特征 (2)可用于显 示各类膜结构 (3)分辨力强，反差好(4)显示图象具有立体浮 雕感(5)样品可长期保存。 缺点：技术难度大，易产生冰晶损伤。 ;;喷镀技术：是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。;5. 扫描电子显微镜技术（SEM）;SEM：扫描电子显微镜 STEM：扫描透射电子显微镜 STM：扫描隧道显微镜 AFM：原子力显微镜是在STM基础上的一种显微镜。 X射线衍射技术：;STM的主要装置包括实现X、Y、Z三个方向扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理显示系统。 STM的主要特点；1.具有原子尺度的高分辨率。侧分辨率0.1-0.2nm，纵分辨率0.001nm；2.可以在真空、大气、液体等多种条件下工作。3.非破坏性测量。与其功能相似的还有原子力显微镜等十于种。 ;第二节 细胞组分的分析方法 一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 1.离心分离技术（1）速度离心分离（差速离心、移动区带离心也称密度梯度离心）（2）等