生物化学教学课件：第四章 蛋白质.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 基本原理 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，（分子筛效应）从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 （2）利用溶解度差别的纯化方法 ①等电点沉淀法 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 ③有机溶剂沉淀法 降低介电常数 争夺水化膜 ②盐析和盐溶法 （2）利用溶解度差别的纯化方法 ①等电点沉淀法 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。 当蛋白质混合物溶液的pH 被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该pH 的蛋白质仍然留在溶液中。 蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀. 常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离. 盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层， 使蛋白质溶解度增加； 盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层， 使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。 ②盐析和盐溶法 蛋白质溶液中，加一定量与水互溶的有机溶剂，这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 常用有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为防止蛋白质分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，且需要在低温条件下进行。 ③有机溶剂沉淀法 （3）利用蛋白质电荷不同的纯化方法 A、电泳：原理与氨基酸的电泳相同 带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。 纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。 SDS boiling 均匀带上一层负电荷 所有的SDS-蛋白质复合体有相同的荷质比 亚基构象改变，SDS-蛋白质复合体为棒状 由于不同的SDS-蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于分子量。 原态蛋白质 肽链伸展 且SDS 以其烃链与蛋白质分子的侧链结合，每克蛋白可结合1.4克SDS，相当于每两个氨基酸残基结合一个SDS。 棒状 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 ? 2比例结合。 PAGE垂直平板电泳示意图 低浓度浓缩胶 高浓度分离胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种物理效应： ①浓缩效应 ②电荷效应 ③分子筛效应 b、离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。此法广泛应用于很多生化物质(例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面。 基本原理 ： 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基因以共价键连接，电荷基因与反离子以离子键结合。 如：纤维素-O-CH2-COO--Na+ 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA++B+ RB++A+ 。 大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。 离子交换层析分离蛋白质 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 基本原理： 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、激素和其受体等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定