Qsep系列全自动毛细管电泳仪在二代测序质控上的应用-.pptxVIP

全自动毛细管电泳仪 Qsep系列Qsep100/400AdvanceQseplite仪器和试剂可在江苏光鼎工厂生产，国产设备，其中Qsep1,100,400具有医疗器械注册证 常用耗材信息S1：高分辨率卡夹，多重检测，引物质检或者需要分辨率的应用；S2：检测文库；F3：替代常规电泳S3: 大片段预制胶卡夹，基因组DNA，FFPE的DNA样本，给出DQNN3: 低浓度大片段样本，低至pg级检测基因组，FFPE，以及三代测序文库N1：低浓度样本，比如，低浓度的游离核酸样本R1：RNA样本，RNA完整性，FFPE的RNA，给出DV200NR1：高灵敏的RNA卡夹，可以检测低浓度RNA样品P：蛋白卡夹，检测蛋白纯度 重复性：同一个marker跑4次稳定性：同一样本三个不同时间点测试灵敏度：标准卡夹可检测到2pg/ul，高敏卡夹灵敏度高10倍达到0.2pg/uL分辨率：500bp之内区分1-4bp仪器性能 灵敏度展示：实际样品检测结果对比2100高敏芯片S2卡夹S2卡夹N1卡夹 重复性好：同一个marker跑10次 NGS质控应用 二代测序质控 片段质控关注点：核酸片段变化的过程文库制备--测序仪、测序方法RNA完整性以及DNA的片段分布核酸片段分布，片段打断、接头连接、文库片段分布 样本制备后--初始样本质控 核酸质量检测总量 纯度 完整性Qubit（荧光）Drop（紫外）qPCR琼脂糖电泳A260/230A260/280A260/A280比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。蛋白质的和酚类的吸光值在280 nm，它们污染了就会导致分母变大。230 nm是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸收谱。 样本质控-核酸样本Drop类浓度检测不准，受纯度影响分光光度法，可检测核酸浓 因素大，不能检测样本完整度和纯度（OD260/280,OD260/230) 性定量准，但不能检测样本纯Qubit荧光定量法，检测核酸浓度 度和完整性可检测片段，可定量，仪器毛细管电泳，可检测核酸的 相对昂贵完整性和浓度Qsep琼脂糖凝胶电泳定量不准，样本消耗量大可检测样本浓度和核酸完整性 全自动毛细管电泳省时省力，安全无毒，分辨率高，灵敏度好置入样品自动分析置入卡匣执行程序替代传统凝胶电泳加缓冲液熔解琼脂糖在高压电场下电泳跑胶完成后拍照、分析 total RNA检测-RQN应用28S18S28S/18S 1.97RQN9.86RNA样本完整性可以通过RQN(RNA Quality Number）来定义完整性 total RNA检测-RQN与A品牌对比 total RNA检测-RQN与A品牌对比 Qsep分辨率更高 total RNA检测-RQN应用RQN:9.84RQN:5.03RNA样本完整性可以通过RQN(RNA Quality Number）来定义完整性 切片 RNA检测-DV200应用DV200:59.1%DV200:76.4%切片的RNA样本，RNA降解严重，RQN值无法准确定义样本完整程度，建议使用DV200（大于200nt的片段比例）进行质控。 cDNA质控片段分布集中的cDNA片段较为弥散的cDNA cDNA质控不合格的cDNA样本合格的cDNA样本 基因组检测-DQN应用以高质量片段的占比作为质控标准，以DQN（DNA Quality Number)来定义DNA样本的完整性 基因组检测-DQN应用DQN: 6.0DQN: 7.8 二代/三代测序质控-DQN应用肺癌FFPE样本质控 cf/ctDNA的质控应用? 提供 cfDNA的大小和纯度数据cfDNAcfDNA with fragmented gDNAFragmented gDNA24 cf/ctDNA的质控应用ctDNA有大片段污染的cfDNAcfDNA：0.07 ng/ul 游离DNA检测-与A品牌检测对比 文库构建质控 文库制备是决定测序成功与否的关键步骤To NGSworkflowDNA fragmentation End conversion and(physical/ enzymatic) adapter additionPCR amplification(optional)Sample DNAFragmented DNADNA fragments withsequencing adapters 片段化核酸质控片段化RNA片段化DNA：200-300bp酶打断超声打断 片段化核酸 二代测序文库质控可通过Smear分析确定文库的主要片段分布区域，以及其平均片段长度 单细胞二代测序文库质控可通过Smear分析确定文库的主要片段分布区域，以及其平