大肠杆菌表达系统详细表格.pptxVIP

1.大肠杆菌表达体系的组成;1.1 大肠杆菌表达载体;2. 转录终止子 启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。 3. 核糖体结合位点 能被核糖体识别的位点，转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。; 4. 转译起始序列 5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。 5. 转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。 6. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。;;常用的大肠杆菌表达载体 1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体 ; lac启动子：控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以参加诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。 理论上，但凡具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都根本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后,仍保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质.;;质粒的构建： 将含有lac启动子的HaeIII 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。;;Trp启动子的表达载体 色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被3-β-吲哚丙烯酸诱导。这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统，并且是诱导型的。 构建： 1. 大肠杆菌染色体DNA的5.4kb HindIII 片断， 含有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、 trpE基因、 trpD基因的局部序列。 2. 将此片断，克隆到pBR322质粒的HindIII 位点，构建成了ptrpED3表达载体〔含有两个HindIII 位点〕。 3. HindIII局部酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个HindIII 位点，经核酸外切酶和S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED5-1.;;PL启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一. λPL启动子：是负责λ DNA分子转录的启动子之一。λPL启动子是可以被 E. coli RNA聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可以被λcI基因产物所抑制。携带λPL启动子的载体使用温度敏感的E. coli cI突变体。在较低的温度下，突变体所产生的cI蛋白可以抑制 λPL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。 ; pPLc24表达载体： 用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。 这个质粒表达载体含有MS2-聚合酶基因开始的98个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。 在MS2-聚合酶基因下游，存在BamHI和HindIII 单切点。EcoRI单切点靠近λ PL启动子，处于转译起始密码子之前。 ;; T7表达系统 大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为根底构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动子控制的基因的转录能到达很高的水平。 ; Cassettes和基因融合 　　 一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要E. coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达信号组成一个cassette。　　某些cassette载体，克隆的基因并不是直接的与核糖体结合位点临近，而是在一段E. coli基因之后，E. coli的基因直接与结合位点相邻。外源基因的