基因克隆的质粒载体详解.pptxVIP

基因克隆的质粒载体详解;质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 单链噬菌体载体 噬菌粒载体 染色体定位整合载体 人工染色体载体 其它特殊用途载体; ; 单独的基因不易进入细胞 进入后不能维持. 三、什么是克隆载体？ vector 通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为DNA克隆载体或基因克隆载体。;载体具有如下功能: 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 ;四、作为克隆载体的DNA分子必须具备主要条件：;五、克隆载体的种类;第8页/共123页;第9页/共123页;第10页/共123页;第11页/共123页;根据用途可分为： 表达克隆载体 启动子探针型载体 cDNA克隆载体等;根据其复制或存在方式可分为: 自主复制型载体和附加载体 ;第四章 基因克隆的质粒载体;质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制 的遗传成份. Plasmid一词由Joshua Lederberg于1952年提出。 质粒的命名: 例:pBR322 ;已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围 较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。 是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝 并将质粒分子精确地分配给子代细胞。 ;其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。 常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。 这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及降解复杂的有机化合物等。;质粒通过合成长 效致死物和短效 解毒剂得以在细 菌中生存.;质粒绝大多数是环形双链的DNA;第20页/共123页;3.环形双链DNA质粒分子组成与构型 多数为双链环状DNA分子. 分子量从不足2kb 到100kb以上,多数为10kb左右. 具有三种不同的构型： 共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的 环形结构。DNA呈超螺旋的SC构型。 开环DNA(ocDNA)：有一??保持完整的环形结构，另一条链 出现有一至数个缺口。即OC构型。 线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。;什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺 旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。 ;第23页/共123页;4. 作为克隆载体质粒的条件 适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括 三种共同的组分： 复制子 选择性标记基因 克隆位点 基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数 ;根据分子特性，革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种;F质粒的tra区包含细菌接合所需的基因;第27页/共123页;质粒的转移与迁移. 转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞. 迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下,从一个细 胞移至另一种细胞. 质粒迁移的条件（自身编码） ①bom位点(col E1) nic 位点. ②mob基因.结合动员基因.编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶, 切割nic位点. 迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.;第29页/共123页;从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。;三亲杂交法;根据质粒的性状特征，可分为五种不同的类型：;根据质粒的转移功能分类;根据质粒的表现分为:;人工构建的质粒根据其功能及用途分为: 　　 (1) 多拷贝质粒 　 (2) 测序质粒 (3) 整合质粒  (4) 穿梭质粒 (5) 表达质粒 (6) 探针质粒 　　;质粒的复制子决定其拷贝数。 复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点,相关的调控元件,复制终点。; 与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列, 都是作为复制子的一部分而被复制. 起始点是一种顺式作用位点,只能作用于该位点所 在的DNA分子.;质粒的拷贝数定义: (1) 通常定义:生长在标准培养条件下(LB培养基)每