实验三质粒的提取.pptxVIP

实验三质粒的提取;【实验目的】;【实验原理】;【仪器、材料与试剂】;(二) 材料 1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.氯仿;9. 乙醇 10．胰RNA酶 11．氨苄青霉素 12．蔗糖 13．溴酚蓝 14．酚 15. 含pUC19质粒的大肠杆菌 16．吸头、小指管 ;(三) 试剂 1. 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl (pH8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8.0) 2. 溶液II 0.4 mol/L NaOH, 2% SDS, 用前等体积混合 3. 溶液III 5mol/L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL;4. TE缓冲液 10 mmoL/L Tris·HCl (pH8.0) 1 mmoL/L EDTA (pH8.0) 5. 70%乙醇 (放-20℃冰箱中,用后即放回) 6. 胰RNA酶 将RNA酶溶于10mmoL/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmoL/L NaCl中, 配成10mg/mL的浓度, 于100℃加热15min, 缓 慢冷却至室温,保存于-20℃。 7. 凝胶加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰。;【实验步骤】;5. 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内溶物，将离心管放冰上5 min。 6. 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置15 min。 7. 12000 r/min离心15min，将上清转至另一离心管中。 8. 向上清中加入等体积酚:氯仿（1:1）或氯仿:异戊醇(24:1)（去蛋白），反复混匀，12000 r/min离心5 min，将上清转移到另一离心管中。;9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10 min。12000 r/min离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10. 用1 mL 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。 11. 加50μL TE缓冲液，(其中含有20μg/mL的胰RNA酶)，使DNA完全溶解，-20℃保存。 12. 紫外分光光度计测定DNA样品浓度(1μL DNA + 49μL H2O)。 13. 电泳检测DNA样品(1-2μL DNA + 1μL loading buffer + 3-4μL H2O);【实验结果】;感谢您的欣赏