酵母核糖核酸的分离及组分鉴定改.pptxVIP

第1页/共16页酵母核糖核酸的分离及组分鉴定改第2页/共16页酵母核糖核酸的分离及组分鉴定第3页/共16页目的与要求1. 了解稀碱法提取RNA的原理、方法2. 掌握核酸中三大组分的鉴定方法第4页/共16页原 理核糖核酸RNA：从细胞核和细胞质中分离出来的化学物质。 在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用，RNA的结构和DNA的结构类似，都是由核苷酸按照一定顺序排列成的长链。 RNA可以分为信使RNA、转运RNA、核糖体RNA以及其他类型的RNA。第5页/共16页磷酸碱基戊糖第6页/共16页酵母菌酵母中主要成分是RNA（2.67～10.0%)，DNA很少 (0.03～0.516%)。第7页/共16页总RNA的提取: 采用稀碱裂解法，乙醇沉淀RNA, 洗涤除杂质；RNA组分鉴定:硫酸可使RNA水解，再分别鉴定第8页/共16页1. 核糖的鉴定——苔黑酚(3,5—二羟基甲苯)法墨绿色第9页/共16页 2. 碱基的鉴定——嘌呤碱嘌呤碱+过量浓氨水+AgNO3絮状嘌呤银化合物 第10页/共16页 3. 磷酸的测定——定磷法(NH4)2MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4)2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10)4+12H2O+12H2O H3P(Mo3O10)4 Mo2O3MoO3(钼蓝）第11页/共16页试剂和器材试剂： 0.04M NaOH；酸性乙醇溶液, 95%乙醇1.5M硫酸；浓氨水，0.1M硝酸银；三氯化铁浓盐溶液 ,苔黑酚乙醇；定磷试剂 器材 研钵，天平； 沸水浴，低速台式离心机。 材料 干酵母第12页/共16页 一.提取步骤改动：5g酵母中加入30 ml 0.04M NaOH，在研钵中研磨均匀，转入大试管，沸水浴20 min，3000转离心10min，取上清，弃沉淀。上清液慢慢倾入10 ml 酸性乙醇中，边加边搅，沉淀RNA静置5min， 3000转离心10min，弃上清，取沉淀。第13页/共16页3.将沉淀用95%乙醇洗两次，约6毫升/管，用于除去表面杂质。第一次将沉淀捣散后再离心5min；第二次将沉淀捣散过滤，旨在将沉淀誊出来，放在滤纸上凉干，称量。（差减法称量，滤纸应提前称好） 4.将所有提取物转移到小三角瓶中，加硫酸进行水解，再分别鉴定组份。第14页/共16页二. 鉴定 1.鉴定磷组分可适当增加，效果更好。2.氨水过量太多也会使沉淀消失；先加硝酸银后加氨水效果明显。苔黑酚显色的特异性较差，凡戊糖都有此反应。准微量DNA无影响，较多DNA存在，亦有干扰。 第15页/共16页离心注意事项：1.样品倒入玻璃离心管不能太满；2.离心前玻璃离心管（套上塑料管套）放在天平上平衡好；3.离心机中对称放置；4.接通电源前确认速度旋钮是否归零，调节定时旋钮设定时间，按开始键开始离心，缓慢调节速度至实际需要速度。第16页/共16页谢谢观看！