蛋白质测定的课件资料.pptxVIP

蛋白质测定的课件资料;实验原理 :;2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。 反应式为: 2NH4++OH-==NH3+H2O NH3+H3BO3==NH4++H2BO3- 3. 再用已知浓度的硫酸标准溶液滴定，根据硫酸消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。 ;实验试剂：;实验仪器：;消化炉;蒸馏单元及电位滴定仪;实验步骤：;2、消化： 将样品称入消化管中，同时称取5g硫酸钾，0.5g硫酸铜然后加入15~20ml浓硫酸，将消化管放入消化炉中，将温度旋钮设定在大约6档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化。 注：决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定的实验室用仪器测量一个特定的样品所得到大量数据，一般选择一个高蛋白，高脂肪的牛奶样品，在透明后用不同的沸腾时间（1-1.5h）测定它的蛋白含量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加，逐渐趋于恒定，然后当沸腾时间更长含量反而降低。选定能得到最大蛋白质的沸腾时间。;3、蒸馏： 把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中，在冷凝器出口的下面放置一个接收瓶，还要把连接管放到接收瓶底端，编辑蒸馏程序，设定硼酸50ml，氢氧化钠65ml，蒸馏时间3—5min。 注：蒸馏时间的确定※ 4、滴定： 用pH为7.00和4.00的缓冲溶液校准电位滴定仪。 设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序，将滴定终点设为PH值4.60，并开始滴定。; 空白试验： 按照上述步骤进行空白试验，在消化管中加入0.85g蔗糖。 ;5、结果表达 ： （V-V0）×c (H+)×0.014 氮含量（％)＝ ×100 m 其中： V ——测定中消耗盐酸标准容液的体积，ml。 V0—— 空白试验中消耗盐酸标准容液的体积，ml。 c (H+) ——硫酸标准溶液H+的摩尔浓度，mol/L。 m——样品质量，g。 四舍六入的结果保留到0.01%。; 蛋白质含量的计算，用质量百分数表达，用氮含量乘以6.38即可。（6.38的含意) 6、回收试验： 方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行检查，按照上述步骤进行， 用0.12g硫酸铵（烘至恒重）加0.85g蔗糖进行测定。回收率应??于99％。 用0.18g色氨酸或0.16g盐酸赖氨酸，加0.67g蔗糖进行测定。回收率应大于98％。 ; 回收率的计算： 用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量21.19％即可。;注意事项 ：;蒸馏装置不能漏气。 蒸馏时保证溶液呈强碱性。 硼酸吸收液的温度不能超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失。 ;混合指示剂临用时混合，它在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。因用硫酸滴定硼酸铵溶液，生成硫酸铵应为强酸弱碱盐，所以溶液呈酸性，指示剂应显红色。 蛋白测定中，在催化剂中加入二氧化钛，消化速度将会更快。能使难以氨化的组分快速氨化。蒸馏时可加入锌粒，其作用相当于沸石，用量如绿豆大即可。 大量结晶体原因。 ;影响实验结果准确性的因数： 称样的准确性： 称样量的选择及称样量的准确度。 仪器的准确性： 蛋白质偏高时，可能的原因： 是蒸馏时蒸汽太大，导致沸腾剧烈，将蒸馏液喷入接收瓶中，蒸馏液中的氢氧化钠会消化一定的硫酸标准溶液，致使结果偏高？;滴定系统中有气泡? 空白值？ NaoH被污染？ 外部因素？ 硫酸标准溶液?;蛋白质偏低时，原因可能是： 消化时的温度太高，消化液喷出？ 蒸馏过程中管路漏气？ 蒸馏开始后NaOH的量？ 冷却水的效果？ 消化时间？ 消化温度？ 硫酸加的量？ 混合指示剂？ ;硫酸的标定：; 称量质量:0.5g时 精确至0.01mg 0.5g时 精确至0.1mg 浓度值在标准浓度值的±5% 标定时需两人各做四次平行样,误差要求按 (GB/T601),在运算过程保留五位有效数字,结果取四位. 在常温下保存时间不超过两个月,出现混浊,沉淀, 颜色变化时应重新配制. 贮存容器不应与溶液反应. ;感谢观看！