淋巴细胞的分离与功能测定.pptVIP

（2）3H-TdR掺入法：氚标记的胸腺嘧啶核苷酸 　　T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TDR），可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过β-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。 优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。 （3）细胞能量代谢测定（MTT法）： MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。 噻唑盐，是线粒体琥珀酸脱氢酶的底物。 MTT proliferation or cytotoxicity assay （二）、B细胞功能检测 1.Ig 的含量检测 2.抗体形成细胞测定 单向琼脂扩散，ELISA，速率比浊法等测定标本中IgG, IgA, IgM等各类免疫球蛋白的含量。 溶血空斑实验 2. 溶血空斑试验 溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响 评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。 临床应用与评价 （三）、细胞毒实验 最常用的方法有： 51Cr 释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法 凋亡细胞检测法 51Cr 释放法 检测原理是用放射性同位素标记靶细胞，当靶细胞遭破坏后放射性同位素即游离于上清液中，经离心分离后，测定上清液或剩余靶细胞放射性的量均可间接地反映NK细胞的活性。 乳酸脱氢酶释放法 基本原理是靶细胞被破坏后将释放乳酸脱氢酶或碱性磷酸酶至培养液中，因此检测培养液中的乳酸脱氢酶或碱性磷酸酶的含量即可以反映靶细胞遭破坏的情况，间接反映NK细胞的活性 细胞染色法： 台盼蓝染色法，活细胞拒染不着色，损伤细胞因 膜通透性增加，燃料进入细胞染成蓝色。 凋亡细胞检测法： 细胞凋亡的形态学检测 梯状凝胶电泳法 FACS TUNEL法 * 第25章 免疫细胞的分离与功能测定 根据各类免疫细胞独特的表面标志及其特殊功能。用体外或体内方法将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来，对其进行数量和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段, 免疫学中进行细胞分离、培养和建立细胞株等研究的重要基本技术之一。 第一节 免疫细胞的分离 一、外周血单个核细胞的分离 二、淋巴细胞及其亚群分离 三、吞噬细胞的分离和收集 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞(monocyte)，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。 一、外周血单个核细胞分离 方法 1.聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque, F-H）密度梯度离心法 原理：聚蔗糖和泛影葡胺按适当比例混合，配成浓度为1.077的分层液，将肝素抗凝血叠加在分层液上，离心后可形成不同层次液体和细胞区带，从而分离PBMC。 红细胞：1.093 粒细胞： 1.092 淋巴细胞和单核细胞的密度：1.075-1.090 BPC为 1.030-1.035 不同细胞密度不同 应用的密度介于1.075-1.092，接近等渗的分层液进行密度梯度离心，可使不同类别血细胞按其相应密度分布，从而被分离。 对分离介质的要求： 对细胞无毒 基本等渗 不溶于血浆及分离物质 有特定的比重 用1.077±0.001的分层液可将PBMC细胞分离 　 稀释的血液 分层液 离心前 稀释的血浆 离心后 红细胞 粒细胞 淋巴细胞分层液 单个核细胞 PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。 为获得高纯度的淋巴细胞或其亚群，可采用如下分离去除方法。 二、淋巴细胞及其亚群的分离和分析 1.去除RBC：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理。 2.去除单核细胞和粒细胞： 1）粘附法：单核细胞和多形核白细胞具有粘附能力，与玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 评价：优点简便易行对细胞损伤极少；缺点B细胞也有一定的粘附能力，此法有所损失。 3.淋巴细胞的分离： （1）E花环分离法：T细胞的CD2结合SRBC，形成E花环，而B细胞不能。经聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心，E花环沉积于管底，用低渗法裂解SRBC，可获得纯化的T。 优点：简便易行，可大量分离T细胞，纯度较高（95-99%），可同时获得B细胞。 缺点：E花环形成后可使T细胞活化。 ＋ B T （2）尼龙棉柱分离法： 原理：B易于粘附尼龙棉纤维，而T不