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基因治疗生物化学第1页/共35页 2一、基因治疗的类型 1. 基因调控治疗 从基因水平调控缺陷基因表达，改善症状 镰型细胞贫血症---用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而关闭的γ基因重新开放，产生HbF代替HbA用反义RNA抑制基因表达核酶（ribozyme）切割RNA阻断基因表达肿瘤治疗，在基因水平抑制肿瘤细胞基因恶性表达和引导肿瘤细胞逆转。第2页/共35页 3基因治疗的类型（续） 2. 基因矫正治疗 基因增补—正常基因导入患者体内补偿缺陷基因功能基因替换—以正常基因取代变异基因基因校正—体外对异常基因进行纠正。第3页/共35页 4基因治疗的类型（续）按矫正基因的类型分为两种基因治疗： · 生殖细胞基因治疗 —对生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因矫正。 · 体细胞基因治疗 —以体细胞为受体细胞，不影响下一代 常用细胞介导法：选择靶细胞在体外进行基因修饰，再将其输入体内。第4页/共35页 5基因置换（gene replacement） 定义：将特定目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。 第5页/共35页 6定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。基因同源重组技术又称为基因打靶(gene targeting）细胞内基因同源重组的发生率很低。基因同源重组技术第6页/共35页 7基因增补（gene augmentation） 定义: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。类型:有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。第7页/共35页 8基因干预（gene interference） 基因失活 定义： 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。第8页/共35页 9（一）反义RNA（antisense RNA） 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 （2）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。第9页/共35页 10反义RNA技转移术 ①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。 借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义RNA转移。第10页/共35页 11反义RNA的优点 受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。 （l）安全性高 （2）反义RNA设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （4）能直接作用于一些RNA病毒第11页/共35页 12核酶 (ribozyme) 天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子而达到治疗疾病的目的。 第12页/共35页 13核酶锤头状的二级、三级结构 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。目 录第13页/共35页 14 1.核酶的设计 核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。 （1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。 （2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。 第14页/共35页 15干扰RNA 1.RNA干扰现象 RNA干扰（RNA inte