实验５蚕豆根尖细胞微核检测技术.pptxVIP

实验５蚕豆根尖细胞微核检测技术;实验５ 蚕豆根尖细胞微核检测技术 一 原理 二 目的 学习蚕豆根尖细胞微核制片与检测技术，了解该技术在诱变作用检测上的应用。;三 材料 蚕豆根尖（新鲜的固定材料） 四 步骤 1 蚕豆浸种催芽 2 待测液对根尖的处理 3 根尖细胞的恢复培养 4 根尖的固定 ;5 根尖的酸水解：将固定的幼根放入青霉素瓶中，用dH 2 O 浸洗2次，除去水后加入5N HCL 将幼根泡住，放入30OC水浴中水解28 min 左右（水解时间与水温有反相关关系），待幼根软化（同时变为半透明）即可取出，用dH 2 O 浸洗幼根2次，5min/次。 6 制片：将幼根放在擦净的载片上，用解剖针截下4mm左右的根尖部分，捣碎，加入1-2滴改良苯酚品红染色液，染色10分钟左右，然后加盖片，压片。 7 镜检：先在低倍镜下找出具微核的细胞，再转入高倍镜进行仔细观察。 五 作业 绘出一个具微核的蚕豆根尖细胞图。;附微核识别标准： 1、凡是主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核； 2、小核着色与主核相当或稍浅； 3、小核形态可为圆形，椭圆形，不规则形等。 凡符合以上3条的小核就是微核（micronucleus,MN);第6页/共29页;微核形成机制：;附：实验数据的处理和污染程度的划分;1）各测试样品（包括对照组）微核千分率（MN‰) 的计算为： MN‰=某测试样点（或对照）观察到的微核数/某测试样点（或对照）观察的细胞数） MN‰ 在10‰以下的为基本污染 10‰ - 18 ‰ 区间为轻度污染 18 ‰ - 30 ‰区间为中度污染 30 ‰以上为严重污染 注：每个处理观察3个根尖，每个根尖记数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数然后平均，即为该处理的微核千分率。;2）污染指数（pollution index);;;In an individual heterozygous for a paracentric inversion, the chromosomes form an inversion loop during pairing in prophase I.;后期Ⅰ染色体桥;倒位的细胞学特征： 粗线期倒位圈；后期桥和断片；微核 倒位的遗传效应： 改变重组率；基因重排;第16页/共29页; 微核试验自70 年代初产生以来的近30 年的时间里,在环境物质遗传毒理检测方面发挥了重要的作用。它以经济、简便、快速、敏感、特异、准确等特点,已成???检测染色体损害的致突变剂和环境污染物的快速初筛试验,已广泛用于筛检具有染色体损伤作用的致突变剂(Mutagens) 和环境污染物( Environmental Pollutants) 。;微核试验的产生与发展; 随着分子生物学技术的迅速发展和不断渗透到微核研究中,使微核试验的检测应用范围不断扩大,现已发展成为能同时检测染色体断裂、染色体丢失、分裂延迟、不分离、DNA 损伤修复障碍、Hprt 基因突变、细胞凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传损害终点 。 ;微核形成机理;核体出芽　 间期的细胞核向外形成瘤状突起,形成芽体最后脱离开主核而形成微核。 ; 自发　在正常情况下生物也会自然出现较低频率的微核,在人类一般随年龄增大而增加,往往女性高于男性。主要由于自身的免疫力低下和超氧化物、自由基、易氧化物等因素较多有关。 化学诱变剂　即染色体断裂剂和非整倍体剂。 细胞组成成份　VB12 、叶酸缺乏可引起微核。 抗氧化剂　谷胱甘肽、VC 、VE、硒等具有降低微核产生的能力,主要是可以清除体内的超氧化物等物质有关。 其他因素　微核也是细胞凋亡的产物,当程序性死亡基因激活,随之Ca[ + + ] 依赖性内切酶激活,切割DNA ,形成细胞核碎片,形态学表现为核深染,染色质边缘分布的帽形核,最后导致微核形成 。;常规微核试验　 是利用细胞生物学方法经显微制片后在显微镜下直接计数待测材料微核率的方法。这是普遍采用的基本方法,可以分为两类: 将微核试验材料,在加入待测物质的环境中培养一段时间,染色制片,显微观察计算微核率。 直接将受遗传毒理损害生物的相应材料制片,显微观察计算微核率。;荧光原位杂交试验与DNA 探针　 荧光原位杂交( Fluorescence in situ hybridization ,FISH) 技术是近年来开展起来的分子生物学新技术。它是使用生物荧光素标记的各类DNA和RNA 探针与细胞或组织在玻片上进行原位杂交,被观察的特定DNA 片段(或序列) 在荧光显微镜下固定在细胞核或染色体的原有部位显示荧光。利用荧光原位杂交试验可以检测是染色体断裂还是染色体丢失,以及可以