培养细胞的观察和检测.pptxVIP

培养细胞的观察和检测 第1页/共25页 一、培养细胞的常规观察 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞常规检查观察的内容为： 第2页/共25页 1、培养液 培养液的颜色和透明度的变化 正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。 随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。 正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。 第3页/共25页 培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。 第4页/共25页 2、细胞生长情况 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。 若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。 第5页/共25页 若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。 第6页/共25页 3 细胞生长状态 细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系，胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，3～4天便可连接成片。成体组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。 第7页/共25页 原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。 第8页/共25页 4、微生物污染细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等应怀疑是否有微生物污染，进一步观察检查并及时处理。 第9页/共25页 二、细胞生长曲线的测定 生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数。通常计数7 d。为精确起见，一般每次计数3瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指教生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。 第10页/共25页 除使用计数法测定细胞的生长曲线外，还可用MTr比色法间接测量之。MTT比色法的主要原理是：MTr被活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲瓒，甲瓒被助溶剂溶解后，可在酶标仪上读取光吸收值(OD)，在一定范围内光吸收值(OD)与活细胞数量呈线性关系。所以可以通过测量OD值，间接测量活细胞数量。 生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在对数生长期的1/3－1/2处加药。细胞计数的时间和次数则依实验目的而定。 第11页/共25页 三、细胞培养的污染检测及其排除 凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。 第12页/共25页 细胞污染的分类 物理污染 化学污染 生物污染（支原体污染）控制污染 掌握良好的无菌操